劉慶華, 賽文博，于孟飛，談 麗

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 湖北省武陵山區(qū)資源植物種質(zhì)改良與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

味覺(jué)是哺乳動(dòng)物的重要感覺(jué)之一，而苦味則是人類(lèi)六種基本味覺(jué)中呈味閾值最低的一種. 味覺(jué)是人類(lèi)自我保護(hù)的一種重要機(jī)制. 因?yàn)榇蟛糠謱?duì)人體有毒有害的物質(zhì)多呈苦味，對(duì)苦味的呈遞和抗拒成為了人類(lèi)避免毒素侵害的第一道防線[1].

現(xiàn)已知TAS2R受體是負(fù)責(zé)苦味感知的主要受體，在人體和小鼠中分別有25種和36種亞型，它們不僅分布在味蕾上，還在腸道、大腦、呼吸道、血管等諸多部位均有不同程度的表達(dá)[2]，這使苦物質(zhì)舒張血管、氣管的研究成為近期的熱點(diǎn).大量研究結(jié)果表明：苦味劑如氯喹(Chloroquine)和苦精(Denatonium)等能顯著影響平滑肌的舒張與收縮[3, 4],苦味劑能舒張由毒蕈堿受體激動(dòng)劑引起的氣道肌肉收縮，其作用途徑是通過(guò)TAS2R - Gβγ蛋白-PLCβ- IP3- IP3R途徑增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并激活BKs ，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化而使細(xì)胞松弛[5, 6]；但另有研究報(bào)道典型苦味劑氯喹還可完全抑制BKs[7].故苦物質(zhì)的作用機(jī)理仍然需要深入研究.

在經(jīng)典理論途徑中，平滑肌的收縮與細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度的升高密切相關(guān)，故苦物質(zhì)可能通過(guò)抑制胞內(nèi)Ca2+濃度的升高而實(shí)現(xiàn)平滑肌的舒張.本文以肌肉張力換能系統(tǒng)為主要工具，以氯喹和苦精為苦物質(zhì)的代表，研究了苦物質(zhì)氯喹在血管平滑肌上的收縮/舒張作用，其內(nèi)皮組織、組織內(nèi)部和外部Ca2+在其中所起的作用，并結(jié)合多種通道阻斷劑探討其作用通路.通過(guò)研究苦物質(zhì)引起血管收縮/舒張的分子機(jī)制，為呼吸道和心血管疾病的預(yù)防和治療提供了理論支持.

1 材料

1.1 試劑和儀器

去甲腎上腺素(Norepinephrine, 遠(yuǎn)大醫(yī)藥中國(guó)有限公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字H42021301), 氯喹(Chloroquine)、苦精(Denatonium)、ROCK的抑制劑(Y27632)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)、茜素紫(Gallein)、硝苯地平(Nifedipine) (美國(guó) Sigma).

生理鹽溶液(2 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1mM.無(wú)Ca2+PSS (0 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, EGTA 0.5 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1 mM.Ca2+母液: CaCl2120 mM.

BL-420S張力換能器、恒溫水浴系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司), PH計(jì)(PHS-2F型, 上海精科), 細(xì)胞培養(yǎng)箱(INE600型, 德國(guó)MEMMERT), 無(wú)菌操作臺(tái)(BSC11B2-1404型, 蘇潔凈化).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，8～10周齡，150～210 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心.在控溫、控濕的條件下，自由飲水進(jìn)食.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照《中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與福利指導(dǎo)手冊(cè)》.

2 方法

2.1 大鼠的處死和胸主動(dòng)脈的分離

大鼠飼養(yǎng)48 h后短頸處死，將口腔和四肢釘在解剖板上，腹部噴灑75%的酒精后剪開(kāi)并向頸部解剖，沿胸腔至頸部結(jié)締組織為止.胸腔剪開(kāi)后，用鑷子小心撥開(kāi)心肺組織，可見(jiàn)大鼠胸主動(dòng)脈處于脊椎上方，取胸腔內(nèi)的主動(dòng)脈約3 cm立即放入事先置于冰上的PSS溶液中待用.

2.2 胸主動(dòng)脈的處理及標(biāo)本上樣

將組織轉(zhuǎn)至解剖鏡下，兩端固定，使用維納斯剪小心除去外周的結(jié)締組織和內(nèi)腔中的殘留血液，用棉線反復(fù)輕柔擦拭血管內(nèi)壁3次以去除內(nèi)皮.處理完成后，將動(dòng)脈剪成長(zhǎng)約6 mm的片段后與掛鉤連接，小心銜接張力換能器后置于內(nèi)有6 mL PSS并持續(xù)通氧的37℃的恒溫水浴槽中.前負(fù)荷調(diào)至300 mg，開(kāi)始平衡.平衡期間，每15 min換液1次，共換液4次.平衡完畢后使用80 mM高鉀溶液進(jìn)行預(yù)刺激，充分刺激組織活性后換液洗脫，至恢復(fù)至基線.5 min后即可開(kāi)始試驗(yàn).

2.3 G蛋白抑制劑共孵育胸主動(dòng)脈

將2.1中的血管環(huán)用滅菌的PSS洗2遍后，轉(zhuǎn)至裝有DMEM的48孔板中，隨即封蓋后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h.對(duì)照組使用DMEM培養(yǎng)基即可，實(shí)驗(yàn)組需加入相應(yīng)濃度的PTX和Gallein對(duì)G蛋白的各個(gè)亞基進(jìn)行阻斷.

3 結(jié)果

3.1 去甲腎上腺素對(duì)于大鼠胸主動(dòng)脈的收縮作用

去甲腎上腺素對(duì)于大鼠胸主動(dòng)脈的收縮作用結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1a可見(jiàn)，去甲腎上腺素(NE)介導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)(rTAVR)的收縮作用呈劑量依賴(lài)效應(yīng).在10 μM時(shí)達(dá)到最大收縮，當(dāng)劑量增大至100 μM時(shí)對(duì)組織的收縮作用不升反降.由圖1b可見(jiàn)，當(dāng)NE的作用濃度達(dá)到1μM時(shí)，胸主動(dòng)脈已經(jīng)基本達(dá)到最大收縮且該濃度不會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用.故后續(xù)試驗(yàn)中以1μM為刺激濃度.

a) NE對(duì)rTAVR收縮作用的量效曲線；b) NE對(duì)大rTAVR收縮作用的統(tǒng)計(jì)圖圖1 NE引起大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)Fig.1 The constrict effect of NE on rat thoracic aorta

3.2 苦物質(zhì)對(duì)于NE引起rTAVR收縮的舒張作用

苦物質(zhì)對(duì)于NE引起rTAVR收縮的舒張作用結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2a和2b可見(jiàn)，Chloroquine和Denatonium兩種藥物均可舒張由NE引起的rTAVR收縮，且這種舒張作用呈劑量依賴(lài)效應(yīng). 由圖2c和2d可知，當(dāng)藥物濃度達(dá)到2～4 mM時(shí)，兩種苦物質(zhì)均可完全舒張由NE引起的rTAVR收縮.當(dāng)藥物濃度達(dá)到4 mM時(shí)，Chloroquine和Denatonium舒張比例分別為(99.74±0.26)%和 (100.00±0.00)% (n=7). 故以Chloroquine和Denatonium為代表的苦物質(zhì)對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌具有高效而迅速的舒張作用.

a,c) Chloroquine ; b,d) Denatonium圖2 氯喹和苦精對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用 Fig.2 The relaxant effect of Chloroquine and Denatonium on rat thoracic aorta

3.3 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于Chloroquine引起的舒張作用的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌功能，包括自分泌和旁分泌，它們可產(chǎn)生內(nèi)皮源的收縮和舒張物質(zhì)，如一氧化氮超極化舒張因子和內(nèi)皮素等[8].為了闡明血管內(nèi)皮細(xì)胞在Chloroquine介導(dǎo)的NE預(yù)收縮的血管平滑肌的舒張過(guò)程中的作用，實(shí)驗(yàn)先使用NE對(duì)rTAVR進(jìn)行預(yù)收縮，再使用乙酰膽堿(Ach)對(duì)內(nèi)皮完整的血管環(huán)產(chǎn)生舒張作用證明內(nèi)皮是否被去除[9]，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)，內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組的血管環(huán)的收縮都均被3mM Chloroquine完全地舒張，其舒張比例分別為(99.89±0.1)% 和(99.97±0.03)% (n=3,p>0.05).故Chloroquine對(duì)血管的舒張作用不依賴(lài)內(nèi)皮組織介導(dǎo)的，它與內(nèi)皮源性的舒張因子無(wú)關(guān)，提示Chloroquine是直接作用于血管平滑肌而導(dǎo)致血管舒張.

a) 內(nèi)皮去除組; b) 內(nèi)皮完整組 圖3 內(nèi)皮組織在氯喹起的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張作用中的影響Fig.3 The effect of endothelium on Cloroquine-induced relaxation in rat thoracic aorta

3.4 Chloroquine對(duì)NE介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣升高的抑制作用

經(jīng)典的平滑肌收縮理論認(rèn)為平滑肌收縮同平滑肌細(xì)胞漿內(nèi)的鈣濃度密切相關(guān).胞漿內(nèi)鈣濃度升高主要通過(guò)細(xì)胞外Ca2+經(jīng)由細(xì)胞膜上的電控或配體型離子通道，如L型鈣通道等進(jìn)入胞漿，或者由IP3引起肌質(zhì)網(wǎng)存儲(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放繼而導(dǎo)致胞漿鈣濃度升高.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Chloroquine對(duì)NE引起的內(nèi)鈣濃度升高的兩條途徑的阻斷作用闡明苦物質(zhì)引起血管舒張的信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4a可知，在3 mM Chloroquine預(yù)處理20 min后，NE在0 mM Ca2+PSS和2 mM Ca2+PSS溶液中均不能引起收縮.由圖4b可知，0 mM Ca2+條件下，NE可引起內(nèi)鈣釋放而引起平滑肌細(xì)胞的小幅度收縮.隨后，“恢復(fù)”平滑肌組織外液Ca2+濃度至正常2 mM，肌張力顯著升高.在血管平滑肌收縮達(dá)到平臺(tái)期后，3 mM Chloroquine可完全舒張NE引起的收縮.以上結(jié)果有力地證明了NE可同時(shí)阻斷平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和外鈣流入而引起預(yù)收縮的血管平滑肌發(fā)生舒張，提示Chloroquine可能通過(guò)阻斷IP3受體介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的釋放而引起血管舒張.

a,b) Chloroquine阻斷NE引起的rTAVR收縮作用;c,d) NE引起rTAVR收縮作用及Chloroquine對(duì)其的舒張作用圖4 Chloroquine對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和外鈣流入通路的阻斷Fig.4 The inhibitory effect of Chloroquine of the release of intracellular calcium stores and extracellular influx

3.5 Chloroquine作用通路的研究

為闡明Chloroquine除阻斷內(nèi)鈣釋放和外鈣流入之外的引起血管平滑肌舒張的其他信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用各種離子通道阻斷劑(Y27632、Gallein、Gd3+、2-APB、Nifedipine)阻斷不同的信號(hào)通路來(lái)研究Chloroquine舒張血管平滑肌的機(jī)制.Y27632為RhoA通路阻斷劑， RhoA-2ROK通路可介導(dǎo)鈣敏感性降低引起的血管平滑肌收縮，這種收縮是鈣非依賴(lài)性的，它主要通過(guò)磷酸化作用抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的活性來(lái)增加肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化水平，從而增強(qiáng)平滑肌的收縮力[10].Gallein為G蛋白β和γ亞基的阻斷劑，苦味的呈遞是由G蛋白介導(dǎo)的，故可通過(guò)阻斷G蛋白的β和γ亞基探明Chloroquine的阻斷作用是否直接作用于G蛋白[11].Gd3+為三價(jià)陽(yáng)離子，可阻斷一系列三價(jià)和三價(jià)以下陽(yáng)離子通道，統(tǒng)稱(chēng)非選擇性陽(yáng)離子通道(NSCC)[12]，其中包括Ca2+、Na+、K+等.2-APB是TRPC通道的阻滯劑，TRPC通道為氯離子通道的一種，它與膜受體激活、Ca2+儲(chǔ)存釋放、細(xì)胞膜脂質(zhì)和運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)[13].Nifedipine為L(zhǎng)型鈣通道特異性阻滯劑，L型鈣通道是一種電壓依賴(lài)性鈣通道的類(lèi)型鈣通道，是介導(dǎo)外鈣進(jìn)入胞漿的最主要途徑之一，故也是影響血管平滑肌收縮和舒張的重要途徑之一.

在37℃，充分通氧條件的水浴槽內(nèi)使用以上多種阻斷劑對(duì)平衡后的rTAVR預(yù)處理20 min后(Gallein在細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)處理6～8 h)，使用1μM NE進(jìn)行收縮，待收縮穩(wěn)定后再使用3 mM Chloroquine對(duì)血管環(huán)進(jìn)行舒張.圖5a為NE引起收縮的統(tǒng)計(jì)圖，圖5b為Chloroquine舒張比例的統(tǒng)計(jì)圖.從圖5可見(jiàn)， Y27632預(yù)處理的血管環(huán)在收縮上與對(duì)照組并無(wú)差異(p>0.05,n=5)，對(duì)Chloroquine的收縮并未起到任何阻斷作用，故Chloroquine并未通過(guò)RhoA舒張NE預(yù)收縮的血管平滑肌. Gallein(n=4)、NSCC (n=3) 和TRPC (n=3) 通路也未在這種舒張作用中發(fā)揮作用.但Nifedipine可以顯著舒張NE預(yù)收縮的血管平滑肌(p=0.025<0.05,n=4).說(shuō)明L型鈣通道很可能是NE引起血管環(huán)收縮的外鈣進(jìn)入細(xì)胞途徑之一，結(jié)合圖3a中Chloroquine對(duì)NE的完全阻斷作用可知，L型鈣通道的阻斷是Chloroquine舒張血管平滑肌過(guò)程中一條重要原因.

a) 各種通道阻斷劑對(duì)于NE引起rTAVR收縮的阻斷作用；b) 各種通道阻斷劑對(duì)于ChloroquinerTAVR舒張的阻斷作用圖5 Chloroquine引起預(yù)收縮的血管平滑肌舒張的機(jī)理Fig.5 The mechanism of Chloroquine-induced relaxation in precontracted thoracic aortic smooth muscle

4 討論

本文首次發(fā)現(xiàn)了以Chloroquine和Denatonium為代表的苦物質(zhì)對(duì)于NE介導(dǎo)的rTAVR的收縮具有快速、高效的舒張作用，初步探討了苦物質(zhì)Chloroquine舒張大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌的作用機(jī)理，結(jié)果表明：(1)Chloroquine可阻斷NE引起的動(dòng)脈平滑肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的釋放；(2)Chloroquine引起的舒張作用與內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管平滑肌舒張和RhoA通路相關(guān)的鈣敏感機(jī)制無(wú)關(guān)；(3)Chloroquine可阻斷L型鈣通道，這也是引起血管平滑肌舒張的主要作用之一，即Chloroquine可同時(shí)阻斷平滑肌細(xì)胞外鈣流入和內(nèi)鈣釋放這兩條信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)肌肉的收縮與舒張.

本文還探討了其他與平滑肌內(nèi)鈣升高有關(guān)信號(hào)通路在苦物質(zhì)引起的肌肉舒張過(guò)程中的作用，但并未驗(yàn)證出除L型鈣通道阻斷以外的其他通路，推測(cè) Chloroquine可能作用于鈣調(diào)蛋白或其他靶分子從而影響肌球蛋白輕鏈的磷酸化作用，造成平滑肌舒張，而且這種舒張作用與離子通道的關(guān)閉或開(kāi)放無(wú)關(guān)；或者苦物質(zhì)可能直接作用于肌球蛋白輕鏈，直接抑制其去磷酸化位點(diǎn)，強(qiáng)制舒張平滑肌；可能由于Chloroquine作用于鈉鈣交換體或鈉泵等蛋白，從而降低胞漿內(nèi)的鈣濃度，造成舒張[8].這些問(wèn)題仍有待深入研究，為其成為高血壓藥物的研究奠定功能性基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn)

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