鄧旭坤，蔡 爽，蔣 捷，陳旅翼，舒廣文，林親雄，梅之南，高康麗

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

“江邊一碗水”為小檗科山荷葉屬植物南方山荷葉DiphylleiasinensisLi.的干燥根莖，又名“窩兒七”、“山荷葉”、“金鞭七”等，被稱為恩施土家族“四大神藥”之一[1,2]，主要分布在湖北恩施的鶴峰、建始、咸豐等地[3].民間土家醫(yī)習(xí)慣上把同科植物八角蓮(Dysosmaversipellis)的根莖也稱之為“江邊一碗水”，因其根莖的莖殘基和葉片均呈碗口狀，藥材大多生長在高山林地靠近水源的蔭涼處而得名.它具有祛風(fēng)除濕、破瘀散結(jié)、活血止痛、鎮(zhèn)咳平喘、解毒等功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、癌癥、跌打損傷、癰腫瘡癤、毒蛇咬傷、月經(jīng)不調(diào)、小腹疼痛等病癥；但毒性較大，因“江邊一碗水”服用不當(dāng)引起急、慢性中毒的病例屢見報道[2,4,5].“江邊一碗水”主要含有木脂素類、黃酮類、皂苷、鞣質(zhì)和多糖等成分，其中以鬼臼毒素(podophyllotoxin)和脫氧鬼臼毒素(deoxypodophyllotoxin)為代表的環(huán)木脂內(nèi)酯型木脂素是“江邊一碗水”的主要的活性成分和毒性成分[6,7].

目前關(guān)于“江邊一碗水”總木脂素(total lignans ofDiphylleiasinensis, TLDS)對動物移植性腫瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)和毒性很少見于報道.本文通過建立移植性肝癌實(shí)體瘤H22小鼠模型，觀察了TLDS對腫瘤的抑制作用及其對荷瘤小鼠的肝腎功能、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的毒性，為尋找“江邊一碗水”抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥材、細(xì)胞和動物

“江邊一碗水”藥材采自恩施鶴峰地區(qū)，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為小檗科山荷葉屬植物南方山荷葉DiphylleiasinensisLi.的干燥根莖.5-氟尿嘧啶(上海晶純試劑有限公司, 批號5402)，0.9 %氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司, 批號130206)，其他為市售分析純試劑.SPF級昆明種雄性小鼠(27～33 g,湖北省疾病預(yù)防控制中心, 42000400000361).H22肝癌細(xì)胞株(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，本室傳代保種.

1.2 總木脂素的制備

TLDS的提?。悍Q取“江邊一碗水”藥材粉末500 g，分別用8倍量、6倍量、4倍量的75 %酸性乙醇回流提取3次每次1 h，所得濾液60 ℃減壓濃縮，調(diào)節(jié)pH值至中性，再用乙醚溶解，經(jīng)多次純化后，60 ℃減壓濃縮成膏狀.

1.3 H22荷瘤小鼠模型的建立

參考文獻(xiàn)[8-10]，取昆明種小鼠，常規(guī)飼養(yǎng).另取傳代保種7～8 d，生長旺盛無潰破的荷H22腹水瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在超凈工作臺上從腹腔抽取乳白色瘤液，經(jīng)臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，用無菌的0.9 %氯化鈉注射液稀釋為1×108/mL的細(xì)胞懸液，接種于小鼠右前肢腋下0.2 mL/只.

1.4 動物分組與給藥

在接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對照組(NS, ig)，陽性對照組(5-FU,10 mg/kg, ip)，TLDS低、中、高劑量組(50, 100, 200 mg/kg, ig).按0.02 mL/g給藥，每天1次，連續(xù)10 d，觀察記錄各組小鼠生存狀況并稱重.

1.5 指標(biāo)檢測

小鼠于末次給藥后禁食不禁水12 h以上，次日脫頸椎處死，剝離瘤塊、胸腺和脾臟，分別稱重，根據(jù)下式計算抑瘤率和胸腺、脾臟指數(shù).

抑瘤率(%)=(平均瘤重模型對照組-平均瘤重實(shí)驗(yàn)組)/平均瘤重模型對照組×100%，

器官指數(shù)=10×器官重量(mg)/實(shí)驗(yàn)后體重(g).

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TLDS對移植性H22荷瘤小鼠腫瘤抑制作用

TLDS對H22荷瘤小鼠抑制作用見表1.由表1可見， TLDS能夠使瘤重明顯減輕，對小鼠腫瘤具有明顯的抑制作用，與模型對照組相比，50 ～ 200 mg/kg能顯著抑制腫瘤的增殖(p<0.01)，呈劑量依賴性； 200 mg/kg TLDS抑瘤效果最好，抑瘤率可達(dá)到62.11 %.而陽性對照組抑瘤率達(dá)84.4%同樣具有較好的抗腫瘤效果.

表1 TLDS對H22荷瘤小鼠腫瘤生長抑制作用(n=10)Tab.1 The inhibitory effect of TLDS on the growth of H22 mice (n=10)

與模型對照組比較,**p<0.01

2.2 TLDS對移植性H22荷瘤小鼠體重的影響

為觀察TLDS對H22荷瘤小鼠的毒性，測定了實(shí)驗(yàn)前后小鼠的體重，結(jié)果見表2.表2中實(shí)驗(yàn)后TLDS各劑量組同實(shí)驗(yàn)前小鼠體重相比無明顯變化(p>0.05)，而實(shí)驗(yàn)后陽性組同模型組相比體重顯著降低(p<0.05).

表2 TLDS對H22荷瘤小鼠體重的影響(n=10)Tab.2 The effect of TLDS on the weight of H22 mice(n=10)

與模型對照組比較,*p<0.05

2.3 TLDS對H22荷瘤小鼠免疫器官重量和指數(shù)的影響

TLDS對H22荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)影響結(jié)果見表3.由表3可見，TLDS低、中、高劑量組均能顯著地提高H22荷瘤小鼠的胸腺的重量及其指數(shù)(p<0.05或p<0.01)；TLDS高劑量組較模型組有提高脾重及脾指數(shù)的作用(p<0.05)，而陽性組較模型對照組相比則有抑制脾指數(shù)的作用.

表3 TLDS對H22荷瘤小鼠免疫器官重量和免疫器官指數(shù)量影響(n=10)

與模型對照組比較,*p<0.05，**p<0.01

2.4 TLDS對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響

白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)的數(shù)量與血紅蛋白(HGB)含量等血常規(guī)指數(shù)是評價動物造血系統(tǒng)狀態(tài)和功能的重要參數(shù). TLDS對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響結(jié)果見表4.由表4可見，陽性組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量顯著性地低于模型組(p<0.01)，說明5-FU對H22荷瘤小鼠的造血系統(tǒng)有明顯的抑制作用.而TLDS各劑量組小鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板的數(shù)量與血紅蛋白含量與模型組相比無顯著性差異(p>0.05)，說明TLDS對H22荷瘤小鼠的造血系統(tǒng)(血常規(guī)指數(shù))無不良影響.

表4 TLDS對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響(n=10)

與模型對照組比較,**p<0.01

2.5 TLDS對H22荷瘤小鼠腎功能的影響

血清中尿酸(UA)和肌肝(CRE)值是衡量腎功能非常重要的兩個指標(biāo).當(dāng)腎功能減退時常伴有血清尿酸(UA)和血肌酐值(CRE)增高，多數(shù)意味著腎臟受損. TLDS對H22荷瘤小鼠腎功能的影響結(jié)果見表5.由表5可見，TLDS各劑量組尿酸與模型組相比含量均顯著性降低(p<0.05)，而TLDS各劑量組血清肌肝含量較模型組無顯著性差別(p>0.05)，說明TLDS對H22荷瘤小鼠腎功能無不良影響.

表5 TLDS對H22荷瘤小鼠腎功能指數(shù)的影響(n=10)Tab.5 The effect of TLDS on renal function index of H22 mice(n=10)

與模型對照組比較,*p<0.05，**p<0.01

2.6 TLDS對H22荷瘤小鼠轉(zhuǎn)氨酶的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平是衡量肝功能非常重要的兩個指標(biāo).對當(dāng)動物血液中的AST和ALT水平異常升高時，說明動物的肝臟受到一定程度的傷害. TLDS對H22荷瘤小鼠轉(zhuǎn)氨酶的影響結(jié)果見表6.由表6可見，TLDS各劑量組與模型組相比谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量均無明顯變化(p>0.05)，說明TLDS對H22荷瘤小鼠的肝功能(轉(zhuǎn)氨酶水平)無不良影響.

表6 TLDS對H22荷瘤小鼠肝功能指標(biāo)(轉(zhuǎn)氨酶)的影響(n=10)Tab.6 The effect of TLDS on liver function index (Transaminase) of H22 mice(n=10)

3 討論

“江邊一碗水”含有多種化學(xué)成分，其主要活性成分為鬼臼毒素類木脂素.鬼臼毒素類木脂素具有顯著抗腫瘤作用長期備受關(guān)注[11,12]，本文建立了體內(nèi)動物移植瘤實(shí)驗(yàn)，不僅研究了“江邊一碗水”中總木脂素部位(TLDS)對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用，還考察了TLDS對H22小鼠的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和肝、腎功能等各方面的影響.結(jié)果表明：TLDS能夠顯著地抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的增殖；在毒性方面，TLDS對H22荷瘤小鼠的體重?zé)o明顯抑制作用； TLDS對荷瘤小鼠的造血系統(tǒng)和肝、腎功能指數(shù)的影響也不甚顯著；還在一定程度上有提高H22荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的趨勢.

總之，TLDS對H22荷瘤小鼠表現(xiàn)出良好的抗腫瘤和較低的毒性，說明TLDS可能是“江邊一碗水”的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，提示改善荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)狀態(tài)和機(jī)能是“江邊一碗水”總木脂素抗腫瘤作用的機(jī)理之一，還有待于深入研究去證實(shí).

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 陳吉炎, 于 萍, 陳師西,等.江邊一碗水的本草考證[J].中藥材,2010,33(2):303-307.

[2] 郭曉莊. 有毒中草藥大辭典[M].天津: 天津科技翻譯出版公司,1992:141.

[3] 鄧旭坤, 蔣 捷, 蔡 爽, 等.江邊一碗水炮制方法的優(yōu)選[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2014,33 (1):45-47.

[4] 于 萍, 陳吉炎, 陳師西, 等.口服鬼臼類中藥中毒46例分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報, 2010, 29(11):1518-1520.

[5] 田金飛, 湯 彥, 苗麗霞, 等. 一例重度“江邊一碗水藥酒”中毒患者的救治體會[J]. 職業(yè)與健康,2010 ,26 (9):1077-1078.

[6] Zhang Z H,Zhang L M,Luo G,et al.Synthesis and bio-logical evaluation of novel podophyllotoxin analogs as antitumor agents[J]. J Asian Nat Prod Res, 2014,16(5):527-534.

[7] 陳吉炎,于 萍,楊光義,等.三種江邊一碗水的比較鑒別(I) [J].中藥材, 2008,31(3):354-357.

[8] 鄧旭坤,蔡寶昌,殷 武,等. Brucine對Heps荷瘤小鼠的抗腫瘤作用和毒性的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報,2006, 22(1):35-39.

[9] 鄧旭坤,趙湘培,米 雪,等. 番荔枝不同部位醇提物對S180荷瘤小鼠的抑瘤和一般毒性作用[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2012,31(2):61-63.

[10] 鄧旭坤,米 雪,蔡 儉,等.竹節(jié)參總皂苷的抗腫瘤作用和毒性研究[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2013, 32(1):47-49.

[11] Giri A,Narasu M L.Production of podophyllotoxin from podophyllum hexandrum:a potential natural product for clinically useful anticancer drugs[J].Cytotechnology, 2000, 34(1/2):17-26.

[12] Wang Y, Yu X, Zhi X, et al. Synthesis and insecticidal activity of novel hydrazone compounds derived from a naturally occurring lignan podophyllotoxin against Mythimna separata (Walker) [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2014, 24(12) :2621-2625.