司佩任 路箏 劉巖 馬建霞 吳洪玉 李兆申

胰腺癌組織125I籽源近距離放射治療是對(duì)位置深在的胰腺癌進(jìn)行內(nèi)放療的一種方法，包括在組織內(nèi)、組織表面或組織附近放置具有放射性的粒子進(jìn)行治療，通過(guò)放射性粒子持續(xù)釋放射線來(lái)達(dá)到最大限度地殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。已有多篇國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道采用B超或CT引導(dǎo)穿刺、術(shù)中定向植入及內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下穿刺等方式植入放射性粒子治療胰腺癌是安全有效的，可明顯改善患者的生活質(zhì)量，尤其可以明顯緩解疼痛反應(yīng)[1-4]。目前，125I籽源治療胰腺癌的分子機(jī)制仍不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺癌組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)高表達(dá)，提示NGF可能由胰腺癌細(xì)胞分泌，從而引起胰腺癌的嗜神經(jīng)特性并導(dǎo)致疼痛的發(fā)生[5]。本研究組前期構(gòu)建了胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)體外模型，并行125I籽源短時(shí)、低劑量近距離照射[6]。本研究建立胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)體內(nèi)模型，植入125I粒子行內(nèi)照射，觀察照射后胰腺癌組織NGF表達(dá)的變化。

一、材料與方法

1．原位胰腺癌模型構(gòu)建及125I粒子植入：20只NOD/SCID健康雄性裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡。用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，按照Fu等[7]方法在鼠的胰尾接種10 μl(108/ml)胰腺癌CAPAN-2細(xì)胞懸液。把胰腺回納腹腔，無(wú)菌條件下縫合腹膜和腹壁。注射6周后，將裸鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為照射組和對(duì)照組。照射組裸鼠在麻醉后、無(wú)菌條件下剖腹，暴露胰尾部接種的腫瘤，測(cè)量大小后將1顆1.0 mCi125I粒子植入瘤體中央，縫合腹膜和腹壁；對(duì)照組植入1顆空粒子。2周后處死裸鼠，測(cè)量腫瘤大小，取腫瘤組織，部分液氮冷凍，部分甲醛固定。

2．NGF mRNA表達(dá)的檢測(cè)：取液氮中的腫瘤組織塊，用研缽研碎，采用Trizol(Invitrogen公司)提取組織總RNA。先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再采用巢式PCP檢測(cè)NGF mRNA 的表達(dá)。使用軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，由上海英俊生物工程技術(shù)有限公司合成。NGF引物上游為5′-AGCAAGCGGTCATCATCCC-3′， 下游1為5′-GGCAGGTCAGGCTCTTCTCA-3′， 下游2為5′-ACCACCGCCACAGACATCA-3′，最終擴(kuò)增片段294 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴(kuò)增片段142 bp[8]。PCR參數(shù)： 94℃ 4 min，94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取均值。

3．NGF蛋白表達(dá)的檢測(cè)：取固定的標(biāo)本，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NGF蛋白的表達(dá)。一抗和二抗均購(gòu)自Abcam公司，工作濃度均為1∶200，最后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、蓋片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。以胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果判定：取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，染色強(qiáng)度分為-、+、++、+++，分別計(jì)為0、1、2、3。陽(yáng)性率=染色強(qiáng)度×(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100。30以上為陽(yáng)性，最高300。

二、結(jié)果

1．照射組和對(duì)照組胰腺癌組織NGF mRNA的表達(dá)：125I粒子照射組及對(duì)照組胰腺癌組織NGF mRNA表達(dá)量分別為0.39±0.19、1.15±0.23，照射組的表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 兩組移植瘤組織NGF mRNA的表達(dá)(M：DNA marker，1、2、3為照射組，4、5為對(duì)照組)

2．照射組與對(duì)照組胰腺癌組織NGF蛋白的表達(dá)：NGF蛋白表達(dá)于癌細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)。125I粒子照射組及對(duì)照組胰腺癌組織NGF 蛋白的表達(dá)量分別為99.90±40.02、171.4±9.18，照射組的表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 照射組(a)和對(duì)照組(b)移植瘤組織NGF蛋白表達(dá)(免疫組化染色 ×400)

討論NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，為神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)所必需。NGF高親和性特異性受體——酪氨酸激酶受體(trkA)是調(diào)節(jié)NGF反應(yīng)的主要成分[8]。NGF在胰腺癌細(xì)胞組織中過(guò)表達(dá)，其受體trkA在周圍神經(jīng)的神經(jīng)束膜上強(qiáng)表達(dá)。NGF與trkA結(jié)合可激活p44/42 MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)浸潤(rùn)遞質(zhì)MMP-2表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的局部浸潤(rùn)、擴(kuò)散和神經(jīng)轉(zhuǎn)移[9-11]。

中腹部疼痛是胰腺癌常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一，給患者帶來(lái)極大的痛苦，嚴(yán)重地影響患者的生活質(zhì)量。這種疼痛通常認(rèn)為是腫瘤的嗜神經(jīng)性，與腫瘤浸潤(rùn)到腹膜后或內(nèi)臟神經(jīng)叢有關(guān)[12]。125I放射性粒子植入體內(nèi)后可以持續(xù)發(fā)出低能量的γ射線，可使乏氧細(xì)胞再氧化，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性，同時(shí)低劑量率照射可以抑制腫瘤的有絲分裂，使腫瘤細(xì)胞因輻射效應(yīng)受到最大程度的殺傷。射線對(duì)腫瘤組織的損傷作用較為復(fù)雜，可直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，也可誘發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。125I籽源植入后組織最大損傷發(fā)生在14 d左右[14]。在外照射模式下的“減瘤效應(yīng)”發(fā)生在125I植入瘤體后，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而壞死范圍逐漸增大。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，晚期胰腺癌疼痛緩解的最佳時(shí)間發(fā)生在125I粒子植入后的7 d內(nèi)，短期疼痛緩解率明顯優(yōu)于長(zhǎng)期緩解率[5-6]，說(shuō)明125I籽源植入后短時(shí)、低劑量率照射緩解疼痛的機(jī)制無(wú)法用傳統(tǒng)的“減瘤效應(yīng)”解釋，可能還存在其他的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，照射組腫瘤組織NGF基因表達(dá)顯著降低，表明125I籽源短時(shí)、低劑量率照射可能抑制胰腺癌細(xì)胞及其間質(zhì)成分產(chǎn)生NGF，提示NGF在胰腺癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤(rùn)中起重要作用，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

參 考 文 獻(xiàn)

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