懷佳萍 葉曉華 蔡振寨 陳燕萍

有學(xué)者認(rèn)為，凝血機(jī)制的異常和血栓形成在重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病機(jī)制中占重要地位[1]，它最終可發(fā)展成彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2]。纖維原樣蛋白2(Fgl2)是一種新型的纖維蛋白原，表達(dá)于各種類型的細(xì)胞，在血栓的形成中發(fā)揮重要作用。它能激活凝血酶原酶，繼而激發(fā)凝血系統(tǒng)，最終形成血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙[3]。但Fgl2在SAP發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。本研究檢測急性胰腺炎(AP)患者外周血單核細(xì)胞和胰腺組織中Fg12的表達(dá)，探討其評估AP嚴(yán)重程度的臨床應(yīng)用價(jià)值。

一、材料和方法

1．標(biāo)本收集：收集12例SAP、6例輕癥急性胰腺炎(MAP)患者外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，以8名健康志愿者的PBMC作為對照。SAP及MAP的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會消化病分會胰腺病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)。另收集2003年至2011年間15例行手術(shù)治療的SAP患者的胰腺組織及11例胰腺癌手術(shù)時(shí)取的癌周胰腺組織，經(jīng)病理檢查證實(shí)為MAP的石蠟切片。

2．實(shí)時(shí)定量PCR：取分離得到的PBMC，應(yīng)用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列： Fgl2上游為5′-CCTGGAGATTGTGGTTTCGT-3′，下游為5′-TACCATGCCTTTCTCCAAGG-3′； 內(nèi)參β-actin上游為5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游為5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。 PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 45 s， 72℃ 60 s，40次循環(huán)。根據(jù)反應(yīng)曲線計(jì)算Ct值(Threshold Cycle)，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

3．免疫組化：采用Envision試劑盒檢測外周單核細(xì)胞和胰腺組織的Fgl2表達(dá)。兔抗大鼠Fgl2多抗工作濃度為1∶100，最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍(lán)，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。在200倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定其平均吸光度值，并進(jìn)行半定量分析。

二、結(jié)果

1．外周血單核細(xì)胞Fgl2 mRNA及蛋白的表達(dá)：SAP組、MAP組、對照組PBMC的Fg12 mRNA相對表達(dá)量分別為2.13±1.00、1.02±0.36、1.00±0.08。SAP組PBMC的Fg12 mRNA表達(dá)顯著高于MAP組及對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而MAP組與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAP組、MAP組、對照組的Fg12蛋白的相對表達(dá)量分別為1.65±0.91、0.87±0.54、0.79±0.1，SAP組PBMC的Fg12蛋白表達(dá)顯著高于MAP組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而MAP組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 SAP組(a)、MAP組(b)、對照組(c)PBMC的Fgl2蛋白表達(dá)(免疫組化 ×200，)

2．胰腺組織Fgl2蛋白表達(dá)：SAP患者胰腺組織Fgl2高表達(dá)，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，MAP患者胰腺組織無明顯Fgl2表達(dá)(圖2)。SAP組、MAP組、對照組胰腺組織Fg12蛋白的相對表達(dá)量分別為2.19±1.12、0.71±0.43、0.86±0.19。SAP組胰腺組織Fg12蛋白表達(dá)量顯著高于MAP組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而MAP組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 SAP組(a)、MAP組(b)胰腺組織Fgl2蛋白的表達(dá)(免疫組化×200，)

3．Fgl2表達(dá)與Ranson、APACHEⅡ評分的相關(guān)性：SAP患者的Ranson、APACHEⅡ評分分別為(3.64±1.19)、(10.88±2.28)分，MAP患者為(1.54 ±0.61)、(6.86±1.60)分，SAP患者較MAP患者顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。SAP患者胰腺組織Fgl2表達(dá)量與SAP患者的Ranson、APACHEⅡ評分均呈正相關(guān)(r值分別為0.937、0.976,P值均<0.01)。

討論SAP為一種炎癥性疾病，在炎癥過程中，纖維蛋白沉積導(dǎo)致的微血栓形成對病情的發(fā)展起重要作用[4]。Fgl2是一種新的促凝劑，能夠通過其替代途徑直接將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，促進(jìn)微血栓的形成[5]。 Fgl2主要表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。

Fgl2啟動(dòng)的凝血途徑是通過“免疫凝血”來實(shí)現(xiàn)的，表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他一些免疫細(xì)胞的Fgl2是由一系列促炎因子所介導(dǎo)的[6]。Clark等[7]報(bào)道，在TNF-α刺激下，滋養(yǎng)層和蛻膜層大量表達(dá)Fgl2，結(jié)果誘導(dǎo)CBA×DBA/2小鼠流產(chǎn)。

本研究結(jié)果顯示，SAP組患者PBMC的Fg12 mRNA及蛋白的表達(dá)較MAP組和對照組顯著上調(diào)，且主要定位于胰腺炎癥區(qū)域所浸潤的間質(zhì)細(xì)胞和微脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)gl2定位與纖維蛋白(原)的定位一致，表明Fgl2的表達(dá)可引起纖維蛋白沉積，導(dǎo)致微血栓形成，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺的病理損傷。雖然本研究采用的MAP組織是胰腺癌周圍的胰腺組織，但Su等[6]報(bào)道肝癌組織及間質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)FgI2蛋白，故MAP組織未表達(dá)FgI2蛋白可排除假陰性的可能性。

通過spearman相關(guān)分析，PBMC的Fgl2表達(dá)與SAP患者入院24 h內(nèi)Ranson、APACHEⅡ評分呈正相關(guān)，因此，檢測PBMC的Fgl2的表達(dá)可能具有早期監(jiān)測SAP嚴(yán)重程度的臨床價(jià)值。此外，抗Fgl2抗體治療或抗Fgl2基因療法的有效性在MHC-3肝炎、移植排斥中也已得到證實(shí)[8]，可以減輕纖維蛋白的沉積和病理損傷，從而為胰腺炎的治療提供新的靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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