池翠杰， 王 偉， 季一兵

(中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京210009)

毛細管電色譜(CEC)具有毛細管電泳(CE)和高效液相色譜(HPLC)的雙重分離性能［1］，被廣泛用于手性藥物、小分子物質(zhì)、生物樣品以及復(fù)雜混合物的分離分析［2-7］。毛細管整體柱具有制備方法簡單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、傳質(zhì)效率高、柱容量高等優(yōu)點，被譽為第4代分離介質(zhì)［8］。聚丙烯酸酯有機聚合物整體柱，因聚合單體選材范圍廣，可靈活在固定相中引入需要的活性基團，且使用的pH范圍寬，在pH 2～12范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在，而成為目前研究最普遍的CEC 固定相基質(zhì)之一［9］。

蛋白質(zhì)類手性選擇劑因獨特的三維結(jié)構(gòu)而對手性對映體有強大的拆分能力［10］。限于蛋白質(zhì)作添加劑時背景吸收會干擾分析測定［11］，因此其作為固定相的應(yīng)用得到迅速發(fā)展［12-14］。但是應(yīng)用于整體柱CEC手性固定相中的報道目前僅限于牛血清白蛋白(BSA)和卵粘蛋白(OVM)［15，16］，且拆分的藥物非常有限，只實現(xiàn)了色氨酸等氨基酸、華法林、安息香的分離，蛋白質(zhì)親和整體柱CEC手性拆分的優(yōu)勢沒有得到充分發(fā)揮。因此探尋拆分能力更強的蛋白質(zhì)手性選擇劑，以CEC整體柱為基質(zhì)制備手性固定相(CSP)是目前較有前景的研究方向。

胃蛋白酶是一種酸性蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為34 600，等電點約為1，由327個氨基酸組成。其作為手性選擇劑適合拆分堿性和中性的手性對映體，具有廣泛的應(yīng)用范圍，已成功應(yīng)用于HPLC和CE對各類光學(xué)異構(gòu)體的分離［17-19］。Fanali等［17］將胃蛋白酶作為手性添加劑應(yīng)用于毛細管區(qū)帶電泳(CZE)實現(xiàn)了普萘洛爾、異丙嗪、維拉帕米等的拆分。Haginaka等［18］將胃蛋白酶鍵合在硅膠顆粒上，制備填充HPLC柱，實現(xiàn)了苯二氮卓艸類、抗組胺類、β-阻斷劑類等25種藥物的拆分，充分體現(xiàn)了胃蛋白酶強大的手性拆分能力。隨后Haginaka等［19］又制備了胃蛋白酶和卵類粘蛋白混合手性HPLC固定相，對異丙基腎上腺素和阿普洛爾具有拆分效果。而以整體柱為基質(zhì)制備胃蛋白酶的CSP在CEC中的應(yīng)用還未見報道。將胃蛋白酶強大的拆分性能和整體柱的優(yōu)勢相結(jié)合會為親和CEC的手性拆分提供新的思路。

本文合成了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacrylate，GMA)-乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethyleneglycol dimethacrylate，EDMA))毛細管整體柱，探討了聚合反應(yīng)條件的影響，優(yōu)化了基質(zhì)柱的制備條件。對合成的整體柱進行了性能考察，在加壓毛細管電色譜模式下將其用于苯等小分子化合物的分離。以聚(GMA-EDMA)整體柱為基質(zhì)，戊二醛為連接臂制備了胃蛋白酶親和整體柱，并應(yīng)用于堿性藥物的拆分，為有機聚合物整體柱對小分子物質(zhì)以及蛋白質(zhì)親和CEC對手性藥物的分離分析提供了方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HP3DCE 7100毛細管電泳儀(美國Agilent公司)，S-3400NⅡ掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);ODGC-14B氣相色譜柱溫箱(日本Shimadzu公司);pHs-25型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電子分析天平(美國 Sartorius公司);SWQ-IA智能數(shù)字恒溫水浴鍋(南京桑力電子設(shè)備廠)。未涂層石英毛細管柱(75 μm I.D.，365 μm O.D.，河北永年光導(dǎo)纖維廠)。GMA、EDMA、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)(純度98%，美國 Sigma公司);正丙醇、1，4-丁二醇、戊二醛、氰基硼氫化鈉(Aladdin公司);偶氮二異丁腈(AIBN)(上海第四試劑廠);胃蛋白酶(美國Sigma公司);奈福泮、氨氯地平、西酞普蘭、撲爾敏均為消旋體;醋酸(HAc)、醋酸銨(NH4Ac)和其余試劑均為分析純;實驗用水為純凈水。上述液體試劑在使用前用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，GMA和EDMA使用前用0.1 mol/L NaOH溶液處理以除去阻聚劑。

1.2 方法

1.2.1 毛細管內(nèi)壁的預(yù)處理

毛細管內(nèi)壁依次用1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液沖洗，然后用水沖洗干凈，N2吹干。將含50%(體積分數(shù))γ-MAPS的甲醇溶液注入毛細管中，毛細管兩端封口，于50℃水浴中反應(yīng)12 h，然后將毛細管置于氮吹裝置上，在0.2 MPa下用甲醇沖洗2 h，N2吹干，備用。

1.2.2 聚(GMA-EDMA)毛細管整體柱的制備

毛細管整體柱反應(yīng)液由活性單體GMA，交聯(lián)劑EDMA，致孔劑體系1，4-丁二醇、正丙醇和引發(fā)劑AIBN組成。GMA和EDMA的質(zhì)量比為3∶2，GMA和EDMA質(zhì)量之和占35%，正丙醇和1，4-丁二醇的質(zhì)量比為3∶1，AIBN的質(zhì)量分數(shù)為1.0%。將反應(yīng)液混勻，通氮氣除氧，過濾，灌注于經(jīng)前處理的毛細管(毛細管總長為35.0 cm，有效長度為25.0 cm)中，兩端封口，于44℃水浴中反應(yīng)12 h。依次用甲醇、水沖洗至整體柱內(nèi)的致孔劑、未反應(yīng)的單體和其他雜質(zhì)去除完全，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 胃蛋白酶親和手性整體柱的制備

于氮吹裝置0.4 MPa恒壓條件下制備胃蛋白酶親和手性整體柱。取4 mL質(zhì)量分數(shù)為25%的濃氨水，加1 mL水，配制成質(zhì)量分數(shù)為20%的氨水溶液，灌入整體柱，于40℃反應(yīng)5 h。取1 mL質(zhì)量分數(shù)為50%的戊二醛溶液，加入4 mL 100 mmol/L磷酸鹽溶液(pH 8.0)，配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的戊二醛磷酸鹽溶液，不斷通入柱中，避光反應(yīng)5 h。室溫下以5 mg/mL胃蛋白酶反應(yīng)溶液(含氰基硼氫化鈉2.5 mg/mL)沖柱12 h，用100 mmol/L NH4Ac-HAc溶液(pH 4.5)沖柱2 h。用電色譜條件下的流動相(15 mmol/L NH4Ac-HAc(pH 5.0))平衡1 h。

1.2.4 整體柱壓力測定

將毛細管一端連接在高效液相色譜儀上，以甲醇或水為流動相，設(shè)定一定流速，使流動相從毛細管的另一端流出，待壓力顯示穩(wěn)定時記錄為柱壓。

1.2.5 電色譜條件

在靠近毛細管整體柱末端處燒制2 mm左右的檢測窗口，檢測窗口與整體柱出口端的距離為1.5 cm。整體柱在分離樣品前，用電色譜條件下待運行的流動相平衡至基線平穩(wěn)。苯同系物的檢測波長為210 nm，氨氯地平、西酞普蘭的檢測波長分別為240、235 nm，奈福泮、撲爾敏的檢測波長為215 nm。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取奈福泮、氨氯地平、西酞普蘭、撲爾敏4種藥物的消旋體，精密稱定，甲醇溶解，分別配制成1 mg/mL的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚(GMA-EDMA)整體柱制備條件的優(yōu)化

嘗試使用環(huán)己醇-十二烷醇致孔劑系統(tǒng)，結(jié)果表明制備的整體柱收縮現(xiàn)象較嚴重，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差，不利于條件的控制，且溶液黏度較大，導(dǎo)致反應(yīng)液不易混勻。故選用溶液黏度適中的脂肪族醇類正丙醇-1，4 丁二醇致孔劑系統(tǒng)［20］。

考察了單體、交聯(lián)劑、致孔劑及溫度對整體柱的柱壓和滲透性的影響，如表1所示。結(jié)果表明:柱壓隨正丙醇和1，4-丁二醇質(zhì)量比的增加而減小。這是因為正丙醇在反應(yīng)系統(tǒng)中屬于不良溶劑，使得相分離發(fā)生較早，形成的聚合物小球較大，其間的空隙也較大，滲透性良好。柱壓隨GMA和EDMA質(zhì)量比的減小而減小。EDMA含量增加，反應(yīng)初期會出現(xiàn)高度交聯(lián)的聚合物，而使相分離發(fā)生較早，這和溶解性差的致孔劑正丙醇效果相似，但交聯(lián)劑含量增加會使得交聯(lián)度增加，機械強度較大。柱壓隨GMA和EDMA總量的增加而增加。根據(jù)相分離原理，致孔劑含量越高，孔隙率越大，滲透性越好。溫度越高，柱壓越大。溫度主要影響AIBN活性，溫度高則產(chǎn)生自由基數(shù)量多，孔隙?。?1］。

綜合考慮滲透性、機械性能和環(huán)氧活性基團含量，初步選定反應(yīng)物配比如1.2.2節(jié)所述。固定上述條件，在40～50℃間調(diào)節(jié)溫度，優(yōu)選適合實驗室氮吹裝置操作的整體柱。通過實驗，最終確定整體柱的反應(yīng)溫度為44℃。

表1 單體、交聯(lián)劑、致孔劑及溫度對整體柱的影響Table 1 Effects of the monomer，cross-linking agent，solvent and temperature on the monolithic column

2.2 聚(GMA-EDMA)整體柱的性能考察

2.2.1 整體柱內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)

用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察柱內(nèi)部形貌(見圖1a～c)，可見其放大50萬倍、5萬倍和1萬倍的斷面結(jié)構(gòu)微孔。在優(yōu)化的實驗條件下制備的整體柱結(jié)構(gòu)均勻，柱內(nèi)同時存在3種孔結(jié)構(gòu):一種是小顆粒與小顆粒之間形成的微孔;另一種是小顆粒與“簇”之間形成的中孔;還有一種是“簇”與“簇”之間形成的大孔，既保證了整體柱有良好的滲透性，又可以使溶質(zhì)和固定相之間充分地相互作用。

圖1d為胃蛋白酶親和毛細管整體柱的掃描電鏡圖，與鍵合前的聚(GMA-EDMA)整體柱并無顯著差別，說明經(jīng)過一系列的反應(yīng)后整體柱的基質(zhì)結(jié)構(gòu)和孔徑依然均勻分布，沒有發(fā)生塌陷、溶脹等。

圖1 整體柱的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning-electron micrographs of the monolithic column

2.2.2 整體柱的耐壓性和滲透性考察

以甲醇為流動相，考察聚(GMA-EDMA)整體柱的耐壓性和滲透性。柱背壓與流動相流速的關(guān)系如圖2所示。結(jié)果顯示柱背壓與流動相流速的線性關(guān)系良好(r2＞0.99)。實驗操作中的壓力在整體柱穩(wěn)定范圍內(nèi)，柱機械強度和抗壓性良好。整體柱的滲透率為2.05×10-18m2，說明其滲透性良好。

以水作為流動相考察胃蛋白酶親和整體柱的柱壓和流速的關(guān)系，并比較胃蛋白酶鍵合反應(yīng)前后整體柱滲透性的變化。由圖2看出鍵合胃蛋白酶后整體柱壓力和線速度仍保持良好的線性關(guān)系(r2＞0.99)。滲透率為1.93×10-18m2，略小于聚(GMAEDMA)基質(zhì)柱。

2.2.3 烷基苯類化合物的分離

圖2 整體柱柱壓與流速的線性關(guān)系Fig.2 Linear dependency of the back pressure of monolith on the linear velocity of eluent

中性化合物在電色譜中的保留主要是通過溶質(zhì)分子和固定相間的色譜作用。聚(GMA-EDMA)整體柱基質(zhì)在電色譜條件下電滲流非常小，使分析物出峰時間過長，故使用所制備的毛細管整體柱在加壓電色譜條件下分離烷基苯類化合物。因加壓CEC模式和高效液相色譜類似，壓力是推動流體前進的驅(qū)動力之一。由烷基苯同系物在此整體柱上的電色譜分離情況(見圖3)可知，烷基苯同系物按照疏水性由小到大的順序依次洗脫;分離度均大于2，峰形良好。9.0%，重復(fù)性良好。不同批次間整體柱上分析物保留因子的RSD均不大于7.9%，分離度的RSD均不大于5.6%。

表2 保留因子和分離度的穩(wěn)定性和重復(fù)性考察Table 2 Reproducibilities and stabilities of retention factors and resolutions

圖3 烷基苯同系物在聚(GMA-EDMA)整體柱上的分離Fig.3 Separation of alkyl benzenes compounds on poly(GMA-co-EDMA)monolith

圖4為乙腈含量對烷基苯同系物保留行為的影響。苯同系物的保留因子(k)隨著流動相中乙腈含量的增加而降低，lg k與流動相中乙腈含量具有良好的線性關(guān)系(r2＞0.98)，說明中性化合物在該整體柱上的保留類似于在反相高效液相色譜上，整體柱表現(xiàn)出了典型的反相色譜特征。

圖4 乙腈含量對烷基苯同系物保留行為的影響Fig.4 Effect of acetonitrile content on the retention of alkyl benzenes

2.2.4 整體柱穩(wěn)定性和重現(xiàn)性考察

以硫脲為標(biāo)記，分離苯、乙苯、丁基苯混合物，考察毛細管整體柱的重復(fù)性，結(jié)果見表2。不同分析物保留因子的日內(nèi)精密度(RSD)均為0.5%，分離度的RSD不大于3.4%;日間精密度均不大于

2.3 胃蛋白酶手性整體柱固定相的性能考察

2.3.1 pH值對電滲流和手性藥物分離的影響

本實驗中整體柱的電滲流(EOF)主要是由胃蛋白酶解離產(chǎn)生，電滲流大小與所用溶液的pH相關(guān)。實驗考察了流動相中緩沖液的pH對EOF的影響。從圖5可以看出，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)整體柱電滲流方向均為正向，且隨著pH的增大而增大。

圖5 pH對電滲流(EOF)和對映體分離度(Rs)的影響Fig.5 Effect of pH on electroosmotic flow(EOF)and resolution(Rs)of the enantiomers

pH值會影響分析物的質(zhì)子化程度及固定相蛋白質(zhì)的離解程度，進而影響分析物與手性固定相的相互作用力及電滲流的大小，從而影響分離。pH大于6.0時胃蛋白酶不穩(wěn)定，因此在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)，考察了其對奈福泮、氨氯地平、西酞普蘭、撲爾敏手性拆分的影響。結(jié)果表明:氨氯地平的分離度隨著pH的增大而增大，pH 5.0時達到最大，隨后隨pH的增大而減小;奈福泮、西酞普蘭和撲爾敏的分離度均隨著pH的增大而增大，在pH 6.0時達到最大。

2.3.2 運行電壓對手性藥物分離的影響

考察運行電壓從10 kV到25 kV變化對奈福泮和氨氯地平對映體分離的影響。結(jié)果顯示，奈福泮對映體的分離度隨著電壓升高而降低，電壓由10 kV增加到25 kV，分離度由3.72降低到1.49。而氨氯地平對映體的分離度隨著電壓增加先增加后減小，在電壓為20 kV時達到分離度最大，為2.03。

在分離的pH(分別為5.0和6.0)條件下，整體柱具有正向的電滲流，說明整體柱帶負電荷。電滲流產(chǎn)生是因pH大于胃蛋白酶的等電點，其帶凈電荷為負。整體柱內(nèi)存在電荷主要為羧基電離產(chǎn)生的負電荷，同時存在氨基電離產(chǎn)生的正電荷。兩種對映體的pKa接近10.0，在分離的pH條件下帶正電荷，因此與整體柱間存在靜電作用;另外，整體柱基質(zhì)本身具有反相色譜特征，與含有苯環(huán)的藥物間存在疏水作用力。

對映體運行的驅(qū)動力除了電滲流外還有自身的電泳遷移。藥物的保留和分離是在上述各因素的綜合作用下實現(xiàn)的。電壓增加，藥物的電泳速度增大，對映體在整體柱內(nèi)保留時間縮短，與整體柱間的各種作用力的作用時間和強度均減小。

因藥物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)不同，導(dǎo)致其疏水性、離解性均不同，導(dǎo)致分離度隨實驗條件變化的趨勢不同。

2.3.3 溫度和進樣量對手性藥物分離的影響

以奈福泮為例，考察溫度對分離的影響。由表3可知隨著溫度升高，奈福泮的分離度和選擇因子均降低，保留時間減小，柱效增加。因CEC同時具有高效液相色譜和電泳的雙重保留機理，溫度升高時溶液黏度減小，電滲流增加，驅(qū)動力增加，因此奈福泮保留時間減小，而對映體與蛋白質(zhì)間的手性“3點作用力”的作用時間因為保留時間縮短而縮短，因?qū)τ丑w均存在色譜保留，即非水作用力時間也減弱，故而分離度減小而柱效增加。

表3 溫度對奈福泮對映體分離的影響Table 3 Effect of temperature on separation of nefopam enantiomers

以奈福泮分離為例考察進樣量對手性藥物分離情況的影響。電壓方式進樣(5 kV×1 s降至1 kV×1 s)，分離結(jié)果表明，減小進樣量時奈福泮的分離度由1.29提高到4.60。進樣量對分離效果影響很大?？赡艿脑蚴撬幬锓肿娱g相互競爭手性選擇劑蛋白質(zhì)的作用位點，而進樣量小時，對映體與固定數(shù)量的有效手性作用位點作用相對更充分，而使分離度增加。

2.3.4 胃蛋白酶親和手性整體柱對藥物的分離

胃蛋白酶親和手性整體柱能夠?qū)崿F(xiàn)對奈福泮、氨氯地平、西酞普蘭、撲爾敏的拆分，前3種藥物都能實現(xiàn)基線分離(見圖6)。

圖6 胃蛋白酶親和手性整體柱分離4種手性藥物的色譜圖Fig.6 Enantioseparation chromatograms of(a)nefopam，(b)amlodipine，(c)citalopram and(d)chlorpheniramine on pepsin-bonded chiral monolithic column

3 結(jié)論

探討了聚(GMA-EDMA)毛細管整體柱合成的影響因素，優(yōu)化了整體柱制備條件。所制備的整體柱內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻、柱滲透性、機械強度良好。在加壓電色譜模式下將整體柱用于小分子物質(zhì)的分離分析，柱效和分離度較高，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，其保留行為具有典型的反相色譜特征，對小分子化合物的分離分析具有指導(dǎo)意義。以戊二醛為連接臂制備了胃蛋白酶親和手性整體柱，在電色譜條件下應(yīng)用于手性藥物的拆分。本研究為蛋白質(zhì)親和CEC的制備和應(yīng)用提供了新的思路和方法。

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