張 帆， 李忠海， 張 瑩， 黃志強(qiáng)＊， 王小淞

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙410004；2.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長沙410004；3.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410004；4.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，廣東 廣州510010）

茶油是我國特有的木本油脂，其憑借超高的不飽和脂肪酸含量以及豐富的維生素、角鯊烯、茶多酚等多種活性成分，可以起到預(yù)防心血管疾病和延緩衰老的營養(yǎng)和保健作用［1，2］。另外茶油自身固有的清香氣味，烹調(diào)過程中產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物也比較少，越來越受到消費(fèi)者的青睞［3］。

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一類廣泛應(yīng)用于塑料包裝材料和塑料制品中以增大塑料的可塑性和韌性的重要有機(jī)化合物［4］。鄰苯二甲酸酯在塑料中屬于游離狀態(tài)，隨著周圍環(huán)境溫度變化和儲(chǔ)存的食品極性等的影響極易從塑料遷移到食品中［5］。目前，國內(nèi)市場(chǎng)上售賣的茶油基本上使用塑料容器包裝，茶油在與含有PAEs的塑料包裝長時(shí)間接觸后，很容易受到塑料包裝中遷移的PAEs污染，污染程度隨著接觸時(shí)間的延長而增加［6，7］。研究表明，具有雌激素特性的PAEs屬于脂溶性物質(zhì)，一旦進(jìn)入人體后便不斷在人體脂肪中富集，極不易排泄出去，從而影響人體正常的內(nèi)分泌功能，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致畸形、癌變和突變［8－10］。

目前有關(guān)食用油中鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)方法主要?dú)庀嗌V法［11］、液相色譜法［12］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［13－15］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［16］等，由于茶油基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾物質(zhì)比較多，現(xiàn)有的這些檢測(cè)方法大都采用凝膠滲透色譜、商品化固相萃取小柱等凈化，消耗了大量的有機(jī)試劑或較為昂貴的前處理耗材。Lijima［17］于1991年發(fā)現(xiàn)的碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）是繼1985年Kroto和Smalley等［18］發(fā)現(xiàn)C60以來碳化學(xué)領(lǐng)域的又一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)。碳納米管因具有獨(dú)特的理化性能，對(duì)重金屬和有機(jī)化合物表現(xiàn)出極強(qiáng)的吸附能力，在樣品前處理應(yīng)用中成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)［19－21］。CNTs存在兩種結(jié)構(gòu)形式：?jiǎn)伪谔技{米管（single－walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）［22］。SWCNTs的直徑通常為0.6～2 nm，相對(duì) MWCNTs而言，其直徑分布的范圍更窄，缺陷更少，從而具有更高的均勻一致性［23］。本研究利用單壁碳納米管的強(qiáng)吸附性，自制單壁碳納米管玻璃固相萃取小柱對(duì)茶油中鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2－乙基）己酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）等6種已經(jīng)被美國國家環(huán)保署（EPA）列為優(yōu)先控制污染物的典型PAEs進(jìn)行富集凈化［12］，結(jié)合 GC－MS測(cè)定，建立了一種簡(jiǎn)便、廉價(jià)、準(zhǔn)確、環(huán)保的茶油中6種PAEs的分析檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS－QP2010 Plus氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊離子源（日本島津公司）；SA300振蕩器（日本 YAMATO公司）；XS20電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；CNW固相萃取裝置（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；MTN－2800D氮吹儀（上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP、DNOP標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于97%。丙酮、正己烷、甲苯（色譜純，美國TEDIA公司），甲醇、二氯甲烷（色譜純，美國MERCK公司），有機(jī)溶劑均重蒸餾，經(jīng)檢測(cè)不含上述增塑劑，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。6 mL玻璃固相萃取空柱管（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；單壁碳納米管：外徑1～2 nm，長度0.5～2μm，純度大于90%，－COOH含量為2.73%，比表面積大于380 m2／g（中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司）；N－丙基乙二胺（PSA）、C18玻璃固相萃取小柱（1.0 g／6 mL，美國 DIKMA公司）。茶油樣品購于湖南某大型超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取6種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.000 1 g），分別置于10 mL容量瓶中，加少量丙酮溶解后定容至刻度線，配制成1.0 g／L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存。使用前根據(jù)檢測(cè)需要移取一定體積的各單標(biāo)儲(chǔ)備液混合后，用甲苯逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SWCNTs SPE柱的制備

準(zhǔn)確稱取0.6 g SWCNTs于6 mL空玻璃SPE柱管中，SPE小柱中填料用配套的6 mL小柱篩板上下固定，壓緊SWCNTs，使填裝柱高度保持在1.5 cm左右。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g茶油樣品于玻璃螺紋管中，用5 mL正己烷溶解稀釋后于振蕩器上振蕩混勻1 min，待凈化。先后用5 mL丙酮溶液、5 mL正己烷溶液活化SWCNTs固相萃取小柱，然后將稀釋的樣品溶液加入到活化后的SWCNTs SPE小柱上，控制流速約為1 mL／min，不收集流出液。為了除去茶油中的油脂，加入20 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，增塑劑吸附在納米管上，達(dá)到凈化的目的。最后用5 mL甲苯溶液洗脫，收集全部洗脫溶液，于氮吹儀上40℃濃縮至1 mL，供GC－MS分析。

1.4 儀器使用條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：HP－5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣：氦氣（純度大于99.999%），流速為1 mL／min，恒流；進(jìn)樣口溫度：280℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL；升溫程序：初始溫度為100℃，保持1 min，以15℃／min升至300℃，保持5 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源（EI）；電子能量：70 eV；溶劑切除時(shí)間：4 min；離子源溫度：250℃；接口溫度：280℃。采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。6種PAEs的保留時(shí)間、定量離子、定性離子見表1。

表1 6種PAEs的保留時(shí)間、定量離子和定性離子Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the six phthalate acid esters（PAEs）

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 正己烷稀釋體積的優(yōu)化

茶油樣品比較黏稠，不能直接過固相萃取小柱進(jìn)行凈化，需要用正己烷進(jìn)行溶解稀釋。稀釋比例過?。从椭^濃）時(shí)，黏度大，流速過慢；比例過大（即油脂過?。r(shí)，溶劑用量大，也浪費(fèi)時(shí)間。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，正己烷的稀釋體積對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，綜合考慮過柱時(shí)間和溶劑用量，最終選定正己烷稀釋體積為5 mL。

2.1.2 吸附材料的選擇

由于碳納米管存在兩種結(jié)構(gòu)形式，實(shí)驗(yàn)比較了單壁碳納米管和多壁碳納米管兩種吸附材料對(duì)茶油中6種PAEs的吸附效果，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管更容易吸附油脂中的PAEs；且單壁碳納米管比多壁碳納米管更具均勻一致性，使得所填充的固相萃取小柱填料更均勻，里面空洞更少。另外分別添加0.1 mL10 mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液到3份空白茶油樣品中，按照1.3.2節(jié)所述步驟進(jìn)行樣品前處理，比較了經(jīng)單壁碳納米管玻璃固相萃取小柱、PSA玻璃固相萃取小柱和C18玻璃固相萃取小柱凈化后洗脫液中的PAEs含量，并計(jì)算回收率。SWCNTs SPE對(duì)選取的6種PAEs的回收率范圍為86.7%～114.6%，PSA SPE為77.9%～120.1%，C18SPE為74.5%～104.8%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自制SWCNTs SPE對(duì)茶油中PAEs的富集和凈化效果不亞于商業(yè)的固相萃取小柱，且對(duì)茶油本身的色素吸附性更強(qiáng)，進(jìn)一步降低了干擾。

2.1.3 SWCNTs用量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)制備的SWCNTs SPE柱中單壁碳納米管的填充質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，SWCNTs用量過少不能將所有目標(biāo)物完全吸附，過多則會(huì)影響上樣速率和洗脫效率。實(shí)驗(yàn)考察了單壁碳納米管用量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g的SWCNTs SPE玻璃小柱，稱取了5份空白茶油樣品各1.00 g并添加0.1 mL 10 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)所述步驟進(jìn)行樣品前處理，檢測(cè)洗脫液中增塑劑的含量，計(jì)算回收率。由圖1可知，DMP、BBP吸附性較強(qiáng)，需要較少的吸附劑，吸附劑用量大時(shí)難以洗脫下來，因此回收率反而降低；DBP、DEHP、DNOP吸附性相對(duì)較弱，需要較多的吸附劑。當(dāng)吸附劑用量為0.6 g時(shí)，所有增塑劑回收率均較好。

圖1 SWCNTs用量對(duì)6種PAEs回收率的影響Fig.1 Effect of SWCNTs dosage on the recoveries of the six PAEs

2.1.4 淋洗溶劑用量的優(yōu)化

因?yàn)檎和榫哂泻芎玫娜芙庵镜哪芰?，為了進(jìn)一步降低樣品中脂肪雜質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的干擾，上樣后，每次用5 mL正己烷清洗，并收集淋洗流出液，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中均不含增塑劑，淋洗液經(jīng)N2吹干后，發(fā)現(xiàn)含油量越來越少，上樣后的SPE小柱經(jīng)20 mL正己烷淋洗之后收集的淋洗液中看不出有油脂存在。所以實(shí)驗(yàn)最終確定固相萃取柱的淋洗液體積為20 mL。

2.1.5 洗脫溶劑類型及洗脫溶劑體積的選擇

洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果也是影響回收率的一個(gè)重要因素。將0.1 mL10 mg／L標(biāo)準(zhǔn)溶液直接上樣到活化的SWCNTs SPE柱上，實(shí)驗(yàn)選取5 mL不同的溶劑（丙酮、甲醇、二氯甲烷、甲苯）進(jìn)行洗脫，計(jì)算洗脫液中增塑劑的回收率。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，甲苯對(duì)6種PAEs的洗脫效果最佳，尤其是對(duì)BBP，而其他3種溶劑對(duì)BBP的洗脫能力很弱。洗脫溶劑的體積也對(duì)目標(biāo)物能否完全從吸附劑上洗脫下來有著至關(guān)重要的影響。實(shí)驗(yàn)比較了2～7 mL甲苯溶液對(duì)上樣0.1 mL10 mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的SWCNTs SPE柱的洗脫效果，由圖3可知，隨著甲苯體積的增加，PAEs的回收率也逐漸增加；當(dāng)甲苯的用量大于5 mL時(shí)，回收率增長緩慢；繼續(xù)增加甲苯用量，PAEs的回收率變化不明顯；另外甲苯沸點(diǎn)較高，濃縮速度稍慢，綜合考慮洗脫溶劑體積和回收率兩個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)最終選擇5 mL甲苯溶液來洗脫固相萃取小柱。

2.2 PAEs測(cè)定條件的優(yōu)化

圖2 洗脫溶劑類型對(duì)6種PAEs回收率的影響Fig.2 Effect of elution solvent types on recoveries of the six PAEs

圖3 洗脫溶劑體積對(duì)6種PAEs回收率的影響Fig.3 Effect of elution volume on recoveries of the six PAEs

鄰苯二甲酸酯是一類含有苯環(huán)的弱極性化合物，為了使6種鄰苯二甲酸酯得到有效的基線分離，對(duì)色譜柱、程序升溫、進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣方式等條件進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4所示，在選定的色譜條件下，6種PAEs在非極性的HP－5MS石英毛細(xì)管柱上能夠有效分離，并獲得滿意的響應(yīng)。在選定了合適的色譜分離條件后，為了進(jìn)一步提高靈敏度和降低基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物分析的干擾，選取干擾較小、響應(yīng)較好的碎片離子作為定量離子和定性離子，采用SIM模式進(jìn)行測(cè)定。

圖4 6種鄰苯二甲酸酯的選擇離子監(jiān)測(cè)色譜圖（1 mg／L）Fig.4 SIM chromatogram of the six PAEs（1 mg／L）

2.3 方法的線性范圍和定量限

將6種PAEs的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲苯稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的儀器條件下測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種PAEs的定量限（LOQ）以空白樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按10倍信噪比（S／N）確定。各被測(cè)組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表2。結(jié)果表明，6種PAEs在0.05～1.0 mg／L范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 9，線性關(guān)系良好。本方法的所有目標(biāo)組分的定量限約0.01～0.03 mg／kg，顯著低于國際限量要求。當(dāng)樣品中6種鄰苯二甲酸酯被檢出且其濃度超過此線性范圍時(shí)，需要適當(dāng)稀釋至此線性范圍內(nèi)。

表2 6種PAEs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r）and limits of quantitation（LOQs）of the six PAEs

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，在經(jīng)檢測(cè)不含有上述6種PAEs的茶油樣品中加入一定量的PAEs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中6種PAEs的添加水平為0.05、0.20、1.0 mg／kg，每個(gè)添加水平取6個(gè)平行樣，按照前述最終優(yōu)化的方法和儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，回收率范圍和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表3所示。在3個(gè)添加水平下6種PAEs的回收率為86.4%～111.7%，RSD為4.2%～10.4%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足痕量分析要求。圖5為空白茶油樣品和添加6種PAEs的茶油樣品的選擇離子色譜圖。

表3 茶油中6種PAEs的加標(biāo)回收率和方法的精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions of the six PAEs spiked in camellia oil（n＝6）

圖5 空白樣品和加標(biāo)樣品經(jīng)SWCNTs SPE凈化后6種PAEs的SIM色譜圖Fig.5 SIM chromatograms of the six PAEs in blank and spiked samples after SWCNTs SPE clean up

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用所建立的方法檢測(cè)了市售多個(gè)品牌和不同批次的30個(gè)茶油樣品，有4個(gè)樣品檢出DBP和DEHP，其中一個(gè)陽性樣品中DBP檢出量為1.04 mg／kg，DEHP檢出量為1.89 mg／kg，超過了 GB 9685－2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的DBP和DEHP所允許的在食品中的特定遷移量限值0.3 mg／kg和1.5 mg／kg。

3 結(jié)論

本文成功地將SWCNTs作為玻璃SPE柱吸附劑用于茶油中PAEs的富集和凈化，能夠有效地去除油脂等大分子的干擾，并結(jié)合GC－MS進(jìn)行分析，建立了一種新的快速、準(zhǔn)確測(cè)定茶油中6種鄰苯二甲酸類增塑劑含量的分析方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所制備的SWCNTs玻璃SPE小柱凈化效果不亞于常用的商業(yè)PSA、C18SPE小柱，且SWCNTs SPE小柱經(jīng)5 mL甲苯洗滌后，可多次重復(fù)使用，大大降低了分析成本。該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、省溶劑、污染小、實(shí)用性強(qiáng)，能夠滿足茶油中PAEs檢測(cè)的需要，也同樣適用于花生油、菜籽油、橄欖油等食用油中PAEs的檢測(cè)。

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