鞏佳第， 曹曉林， 曹趙云， 卞英芳， 于莎莎， 陳銘學(xué)

（中國水稻研究所 農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 杭州310006）

水稻是除飲用水以外，人體對(duì)砷攝入的最主要來源［1］。大量研究表明，稻米中砷主要以無機(jī)態(tài)的砷酸鹽、亞砷酸鹽，以及有機(jī)態(tài)的二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）和少量的砷甜菜堿（AsB）等形式存在［2－4］。由于無機(jī)砷的毒性高于有機(jī)砷，目前國內(nèi)外僅對(duì)稻米中的無機(jī)砷限量做出規(guī)定，但研究表明，有些有機(jī)砷可能與癌細(xì)胞活性有關(guān)，也存在毒性［5－7］。因此，對(duì)稻米中各種砷形態(tài)進(jìn)行全面的分析才能科學(xué)、客觀地對(duì)稻米砷安全做出評(píng)價(jià)，并開展相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

在稻米砷形態(tài)分析中，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)各形態(tài)完全提取，同時(shí)又要避免形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化，是其主要的技術(shù)難點(diǎn)［8，9］。研究認(rèn)為稻米基質(zhì)中的巰基化合物（如谷胱甘肽、半胱氨酸等）在低氧化還原環(huán)境中，可將砷酸根［As（V）］部分還原為亞砷酸根［As（Ⅲ）］，而使得As（Ⅴ）測(cè)定結(jié)果偏低；若采用過強(qiáng)的氧化體系提取，則導(dǎo)致As（Ⅲ）的響應(yīng)降低，甚至不能被測(cè)定［10－12］。目前，基于酸體系結(jié)合熱輔助提取技術(shù)被認(rèn)為是解決上述問題的有效途徑，如近幾年報(bào)道的硝酸熱輔助提取法、甲醇－HNO3熱超聲浸提法、三氟乙酸微波萃取法等［13－15］。但這些技術(shù)的提取效率存在明顯的差異，且酸介質(zhì)對(duì)后續(xù)的色譜分離非常不利，如極易引起常規(guī)離子交換柱的柱效下降及柱壓上升等。此外，在加熱方式上，與本文采用的石墨消解儀相比，微波消解存在分析效率較低、分析成本較高的問題，而電熱板的控溫能力相對(duì)較弱。由此可見，針對(duì)稻米中5種砷形態(tài)的提取、分離方法，還有待于進(jìn)一步完善和統(tǒng)一。

本工作采用石墨消解法提取，以耐酸較強(qiáng)的Dionex IonPac AS19陰離子交換柱為色譜分離材料，在對(duì)幾種常用 的砷形 態(tài) 提取方法［13，14，16，17］進(jìn) 行比較的基礎(chǔ)上，對(duì)提取試劑的濃度、提取時(shí)間和提取溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合ICP－MS高靈敏度檢測(cè)，成功地建立了稻米中5種砷形態(tài)的檢測(cè)方法，方法簡單、準(zhǔn)確、耐用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、X－series 2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP－MS，美國ThermoFisher公司）、PM400電子天平（瑞士 METTLER公司）、PHS－3C精密pH計(jì)（上海雷磁儀器公司）、MS3 basic漩渦振蕩儀（德國IKA公司）、Cyclotec 1093旋風(fēng)研磨儀（丹麥Foss公司）、KQ－800TED型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Primo R離心機(jī)（美國 ThermoFisher公司）、DigiBlock ED－54石墨消解儀（萊伯泰科公司），Oasis MAX小柱（3 mL／60 mg，美國 Waters公司）。

1.2 試劑與材料

磷酸二氫鈉、無水乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（分析純，F(xiàn)luka），硝酸鉀（分析純，Aldrich），氫氧化鈉（分析純，ACROS），乙醇（色譜純，Merck），三氟乙酸（TFA，純度≥95.0%，ACS），硝酸（68%～70%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司），甲醇（色譜純，Merck）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli－Q高純水。

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：As（V）（GBW08667）、As（Ⅲ）（GBW08666）、 AsB （GBW08670）、 MMA（GBW08668）、DMA（GBW08669）以及砷單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg／L）均購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用純水將5種砷形態(tài)稀釋成質(zhì)量濃度均為2 mg／L（以As計(jì)）的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中避光保存。砷標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

實(shí)驗(yàn)室稻米樣品隨機(jī)采購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.3 砷形態(tài)分析

1.3.1 樣品預(yù)處理

取待測(cè)稻米樣品于旋風(fēng)研磨儀中粉碎，過80目篩，準(zhǔn)確稱取樣品1.000 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.3 mol／L硝酸水溶液，渦旋混勻，再置于石墨消解儀中在95℃下提取90 min。將提取液冷卻至室溫，在8 000r／min下離心15 min，上清液過0.22μm濾膜后，供LC－ICP－MS分析。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件中的流動(dòng)相參考國家標(biāo)準(zhǔn)［18］；流速0.9 mL／min；進(jìn)樣體積20μL。陰離子保護(hù)柱IonPac AG19（50 mm×4 mm，Dionex）；陰離子分析柱IonPac AS19（250 mm×4 mm，Dionex）。

ICP－MS工作參數(shù)：功率1 224 W，輔助氣流量0.8 L／min，冷卻氣流量12 L／min，霧化氣流速0.95 L／min，采集質(zhì)量數(shù)砷75，載氣（氬氣）純度≥99.999%。

1.4 總砷含量的測(cè)定

總砷含量測(cè)定參照國家標(biāo)準(zhǔn)［19］。隨機(jī)選取了一個(gè)稻米樣品，按該方法測(cè)定，其結(jié)果為235.7 μg／kg（n＝5），用于下文中對(duì)提取方法的優(yōu)化研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的選擇

目前針對(duì)砷形態(tài)的提取溶劑主要有有機(jī)試劑、無機(jī)試劑以及復(fù)合試劑，另外還有酶試劑提取等［15，20－22］。比較了50%（v／v）甲醇水溶液（含1%（v／v）硝酸水溶液）、0.3 mol／L硝酸水溶液、3%（v／v）三氟乙酸（TFA）水溶液和水4種提取試劑對(duì)5種砷形態(tài)的提取效率。其中，甲醇提取法于55℃下超聲30 min，提取液在6 000 r／min下離心15 min，上清液過MAX柱后上機(jī)分析；0.3 mol／L硝酸水溶液提取按1.3節(jié)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行；3%三氟乙酸提取法于80℃下浸提2 h；水提取法于90℃下浸提3 h，三氟乙酸水溶液和水提取法所得提取液都以8 000 r／min離心15 min，上清液過0.22μm濾膜后上機(jī)分析。上述4種提取劑對(duì)5種砷形態(tài)的提取效果見圖1。

圖1 4種提取試劑對(duì)5種砷形態(tài)的提取量（n＝3）Fig.1 Extraction amounts of the five arsenic species with the four extraction reagents（n＝3）

由圖1可以看出，以0.3 mol／L硝酸水溶液對(duì)總砷（這里指各形態(tài)之和）的提取量最多（232.5 μg／kg），其提取效率達(dá)98.6%；水和 TFA其次，對(duì)應(yīng)的提取效率分別為93.8%和88.9%；而50%甲醇最低，提取效率僅為49.2%。其次，從各砷形態(tài)的提取量來看，總體上仍以0.3 mol／L硝酸水溶液效果最好，其中 As（Ⅴ）、MMA、DMA、As（Ⅲ）和 AsB的提 取 量 分 別 為 35.1、6.9、58.1、130.9、1.5 μg／kg，而TFA和甲醇試劑幾乎不能將MMA提取出來。此外，純水的總體提取效果雖僅次于0.3 mol／L硝酸水溶液，但對(duì)As（Ⅴ）和DMA的提取效果較差，其提取量僅為0.3 mol／L硝酸水溶液的86.3%和81.1%。綜合考慮，以0.3 mol／L硝酸水溶液對(duì)稻米中砷形態(tài)的提取效果最好。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 硝酸濃度對(duì)5種砷形態(tài)提取效率的影響

將提取溫度和提取時(shí)間設(shè)為95℃和90 min，分別考察了0、0.15、0.3和0.45 mol／L硝酸水溶液對(duì)各形態(tài)砷的提取效率及形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響，提取過程按1.3.1節(jié)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行，結(jié)果見圖2。

圖2 不同硝酸濃度下5種砷形態(tài)的提取量（n＝3）Fig.2 Extraction amounts of different concentrations of nitric acid on the five arsenic species（n＝3）

由圖2可以看出，當(dāng)試樣采用不同濃度的硝酸提取時(shí)，其對(duì)As（Ⅲ）和AsB的提取量影響不明顯，而DMA、As（V）和MMA的提取量總體上均隨著硝酸濃度的增加而提高，且當(dāng)硝酸濃度為0.3 mol／L時(shí)，這3種砷形態(tài)的提取量基本均達(dá)到最大，同時(shí)，總砷提取效率也達(dá)到最高（100.2%）。

從硝酸對(duì)As（V）和As（Ⅲ）的轉(zhuǎn)化影響來看，只有當(dāng)硝酸濃度≥0.15 mol／L時(shí)，稻米基質(zhì)中還原性物質(zhì)才能得到完全抑制，相應(yīng)地As（V）提取量則有了明顯的上升，之后便保持穩(wěn)定。對(duì)于As（Ⅲ）而言，與不含硝酸的提取液相比，其在0.15 mol／L的硝酸水溶液中僅下降4%，基本不影響測(cè)定；而當(dāng)硝酸濃度再增大時(shí)，則幾乎不發(fā)生變化。綜合考慮，選擇0.3 mol／L為最佳硝酸濃度。

2.2.2 提取溫度的選擇

以0.3 mol／L硝酸水溶液為提取劑，提取時(shí)間設(shè)為90 min，考察了不同溫度（65、75、85、95、105℃）對(duì)5種砷形態(tài)的提取效率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度下5種砷形態(tài)的提取量（n＝3）Fig.3 Extraction amounts at different temperatures of the five arsenic species（n＝3）

圖3表明，隨著提取溫度的升高，除AsB和DMA的提取效率無明顯變化外，其余3種形態(tài)砷的提取效率總體呈上升趨勢(shì)。當(dāng)溫度提高至95℃時(shí)，5種砷形態(tài)的提取量基本均達(dá)到最大，與65℃時(shí)相比，As（Ⅲ）、As（V）和 MMA的提取量分別上升了24.4%、38.8%和73.9%，且總砷提取效率也達(dá)到最高（100.8%）。從各形態(tài)變化趨勢(shì)看，As（Ⅲ）在85℃時(shí)提取量就有明顯的提升且之后便趨于穩(wěn)定。而對(duì)于As（V）和MMA，只有溫度提高至95℃時(shí)，其提取量才有明顯的上升，之后保持穩(wěn)定。因此，選擇最佳提取溫度為95℃。

此外，還考察了提取時(shí)間對(duì)5種砷形態(tài)提取效率的影響。提取時(shí)間在30～180 min內(nèi)，每隔30 min進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除提取時(shí)間少于60 min時(shí)的提取率低以外，其余時(shí)間點(diǎn)對(duì)稻米中各形態(tài)砷的提取效率無明顯差異。為取得較好的提取效率和穩(wěn)定的結(jié)果，選擇提取時(shí)間為90 min。

2.3 對(duì)5種砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的考察

為進(jìn)一步考察樣品提取過程中砷形態(tài)是否發(fā)生轉(zhuǎn)化，對(duì)空白稻米（僅As（Ⅲ）有檢出，含量為1.93 μg／kg）分別進(jìn)行100μg／kg的單一形態(tài)加標(biāo)試驗(yàn)（n＝3）。按照1.3.1節(jié)的步驟進(jìn)行處理，結(jié)果表明，稻米中添加As（V）后，對(duì)應(yīng)的檢出值為93.66 μg／kg，回收率為93.7%，并沒有As（Ⅲ）及其他形態(tài)檢出。同樣，對(duì)As（Ⅲ）、AsB、MMA和 DMA的添加試驗(yàn)表明，其回收率為92.5%～98.5%，也未發(fā)現(xiàn)有砷形態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。以上研究結(jié)果與Huang等［9］以及 Zhang等［23］的結(jié)果相似。因此，采用0.3 mol／L的硝酸于95℃下消解1.5 h，可避免稻米中5種砷形態(tài)的相互轉(zhuǎn)化。

2.4 線性范圍和檢出限

將5種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成含AsB和 DMA0.05、0.5、5、50、200μg／L，As（Ⅲ）和MMA0.1、1、10、100、400μg／L，As（V）0.15、1.5、15、150、600μg／L的混合溶液。在最佳的儀器條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以各形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg／L），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，各分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不低于0.999 9。

取5種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按確定的方法測(cè)定，以不低于3倍信噪比（S／N≥3）確定方法的檢出限（LOD），以S／N≥10確定方法的定量限（LOQ）。結(jié)果如表1所示，5種砷形態(tài)的LOD為0.15～0.45μg／kg，LOQ為0.50～1.50μg／kg。

表1 5種砷形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限（LOD）與定量限（LOQ）Table 1 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the five arsenic species

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

本工作分別通過國家大米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10010）結(jié)合加標(biāo)回收方式考察方法準(zhǔn)確度和精密度。由表2可看出，本方法對(duì)大米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中各形態(tài)之和（Sum）的測(cè)定結(jié)果為99.15μg／kg，與其標(biāo)準(zhǔn)值（102±8）μg／kg基本一致。

表2 GBW10010中5種砷形態(tài)含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5）Table 2 Contents and RSDs of the five arsenic species in GBW10010（n＝5）

本工作在粉碎的大米中加入5、50μg／kg的AsB和 DMA，10、100μg／kg的 As（Ⅲ）和 MMA，15、150μg／kg的As（V），按照1.3.1節(jié)的步驟進(jìn)行處理，分別測(cè)定5種砷形態(tài)的回收率及其精密度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在2個(gè)加標(biāo)水平上，各形態(tài)的回收率為89.6%～99.5%，RSD 為0.6%～3.6%。兩種驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法回收率高，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

利用建立的方法對(duì)市場(chǎng)上15份稻米樣品進(jìn)行了測(cè)定（n＝3），結(jié)果如表4所示：15份樣品中無機(jī)砷（iAs，As（Ⅲ）與As（V）之和）的含量均低于限量值（200μg／kg），全部符合我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［5］。從各形態(tài)的檢測(cè)結(jié)果看，稻米中砷主要以As（Ⅲ）形式存在，對(duì)應(yīng)的含量為35.96～150.83μg／kg；其次為DMA和 As（V），對(duì)應(yīng)的含量分別為5.24～98.13 μg／kg和4.18～13.63μg／kg；僅13號(hào)樣品中檢出少量的AsB，其含量為0.61μg／kg。

表3 大米基質(zhì)中5種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5）Table 3 Recoveries and RSDs of the five arsenic species spiked in rice（n＝5）

表4 稻米樣品中5種砷形態(tài)的測(cè)定結(jié)果（n＝3）Table 4 Results of the five arsenic species in rice samples（n＝3） μg／kg

5種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg／L）的色譜圖見圖4，兩個(gè)大米實(shí)際樣品（15號(hào)和13號(hào)）的色譜圖見圖5。從這些色譜圖中可以看出，采用所建立的樣品預(yù)處理方法及儀器條件，5種砷形態(tài)均得到基線分離，且峰形良好、靈敏度較高，說明該方法能滿足稻米中砷形態(tài)分析的要求。

圖4 5種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的LC－ICP－MS色譜圖Fig.4 LC－ICP－MS chromatogram of the mixture of the five standards of arsenic species

圖5 15號(hào)和13號(hào)大米樣品中5種砷形態(tài)的 LC－ICP－MS色譜圖Fig.5 LC－ICP－MS chromatograms of the five arsenic species in rice samples No.15 and No.13

3 結(jié)論

以0.3 mol／L硝酸水溶液為提取劑，基于石墨消解儀控溫提取，解決了目前對(duì)稻米中5種砷形態(tài)提取效率低、各形態(tài)間易轉(zhuǎn)化的難題。結(jié)果表明，該提取方法回收率高、操作簡單，尤其適合于高通量分析。此外，本研究采用Dionex IonPac AS19陰離子交換柱對(duì)5種砷形態(tài)進(jìn)行分離和ICP－MS檢測(cè)，極大地提高了方法的耐用性和分析靈敏度。由此可見，本方法適合于稻米中5種砷形態(tài)的準(zhǔn)確定性、定量分析。

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