石銀濤， 郭璟琦， 王繪軍， 段 杰， 喻洪江， 鄭 經(jīng)， 王俊偉＊

（1.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶400021；2.重慶警察學(xué)院禁毒系，重慶401331）

抑郁癥是一種常見的精神疾病。目前中國的抑郁癥患者已超過2 600萬，在自殺和自殺未遂人群中，抑郁癥患者占了50%～70%［1］。近年來，大學(xué)生患抑郁癥的比例高達(dá)3%～5%，已經(jīng)成為不可忽視的社會(huì)問題［2］，且在逐年遞增的大學(xué)生自殺案例中，有60%都與抑郁癥或精神分裂癥等精神疾病有關(guān)。目前，抑郁癥尚無法根治，最基本、最重要、見效最快的方法就是進(jìn)行藥物治療。

抗抑郁類藥物因具有抑制躁狂、抗焦慮和抗驚厥等作用而被越來越廣泛地應(yīng)用于抑郁癥治療。但濫用、誤用該類藥物或利用此類藥物投毒迷奸的事（案）件時(shí)有報(bào)道。因此，法庭科學(xué)和毒物檢測(cè)領(lǐng)域?qū)挂钟纛愃幬锏臋z測(cè)要求也日益增高［3］。

目前，抗抑郁類藥物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）［4］、高效液相色譜法（HPLC）［5］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［6－10］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）［11－17］。GC和LC對(duì)樣品前處理要求嚴(yán)格，樣品中的基質(zhì)干擾使檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽性，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析，不能作為最終的確認(rèn)方法。由于抗抑郁類藥物不易揮發(fā)，GC－MS方法檢出限高、靈敏度較低，且不適合做定量分析?；诙喾磻?yīng)監(jiān)測(cè)模式的LC－MS／MS因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性動(dòng)態(tài)范圍寬等特點(diǎn)，在抗抑郁類藥物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛；但是該方法建立的過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)的目標(biāo)物數(shù)量有限，且不能提供精確質(zhì)量數(shù)，在痕量多組分的定性分析和快速篩查中存在不足。以四極桿／飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q－TOF／MS）為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)在其掃描質(zhì)量范圍內(nèi)可提供目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)，且具有質(zhì)量分辨率高、分析物數(shù)量不受限制、選擇性高、基質(zhì)干擾小、方法建立過程簡(jiǎn)單以及數(shù)據(jù)庫檢索方便等優(yōu)點(diǎn)，因此在復(fù)雜基質(zhì)的目標(biāo)物分析中有著廣泛的應(yīng)用前景［18－22］。LC－Q－TOF／MS不僅可以獲得目標(biāo)物的分子離子信息，還可以在碰撞碎裂后獲得豐富的碎片離子信息。這些碎片離子的精確質(zhì)量信息使其定性確證能力更強(qiáng)［23］。

常用的樣品前處理方法有液液萃取和固相萃取。液液萃取操作繁瑣、需要大量的有機(jī)溶劑，且重現(xiàn)性差。固相萃取具有有機(jī)溶劑使用量少、選擇性強(qiáng)、分離時(shí)間短、凈化效果好等優(yōu)勢(shì)，能顯著提高血液中抗抑郁類藥物的提取回收率。另外，固相萃取可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，不但能夠節(jié)省時(shí)間和人力成本，并且具有重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

本文將自動(dòng)固相萃取技術(shù)和LC－Q－TOF／MS結(jié)合，通過Q－TOF／MS的target MS／MS功能獲取二級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性分析，同時(shí)通過對(duì)LCQ－TOF／MS總離子流圖中目標(biāo)物進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)窗口（＜2×10－5Da）的提取，利用提取離子流峰面積進(jìn)行定量分析。因此通過精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、同位素豐度、同位素間距、碎片離子等進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索比對(duì)，能夠在一次分析中完成高選擇性的定性分析和高靈敏度的定量分析，可以方便快速地對(duì)血液中卡馬西平（carbamazepine）、多慮平（doxepin）、氯氮平（clozapine）、阿米替林（amitriptyline）和米氮平（mirtazapine）等抗抑郁類藥物實(shí)現(xiàn)篩查與確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290－6550超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization（Dual AJS ESI）源（美國 Agilent公司）；固相萃取儀 GX－274（美國 Gilson公司），AE240電子天平（精度為萬分之一，瑞士 Mettler Toledo公司）、Allegra X－22R Centrifuge型冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）、Millipore Direct－Q3型純水機(jī)（美國Millipore公司）等。

HLB固相萃取柱（60 mg／3 mL，美國 Waters公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），其他試劑均為分析純。

卡馬西平、多慮平、氯氮平、阿米替林和米氮平標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98.0%，均購自美國Sigma公司。結(jié)構(gòu)式見圖1所示。

準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后搖勻，貯備液于－18℃下保存，使用時(shí)根據(jù)需要用甲醇稀釋配制成不同濃度的單標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

圖1 5種抗抑郁類藥物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of the five antidepressants

1.2 樣品前處理

取1 mL血液于15 mL具塞離心管中，加2 mL去離子水稀釋，用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH為9，渦旋混勻，待凈化。

固相萃取：將待凈化液以9 500 r／min速率離心5 min，取上清液待過柱。將HLB固相萃取柱依次加3 mL甲醇、3 mL去離子水活化。將上清液過柱，用3 mL去離子水淋洗，用3 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈桑患尤? mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供LC－Q－TOF／MS分析。

液液提?。捍齼艋褐屑尤? mL乙醚，渦旋振蕩，混勻后超聲5 min，以9 500 r／min速率離心5 min，取上清液；重復(fù)提取1次；合并上清液，用氮?dú)獯蹈?；加? mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^0.22μm有機(jī)濾膜，濾液供LC－Q－TOF／MS分析。

1.3 液相色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）及Extend C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）（美國Agilent公司）；柱溫35℃；進(jìn)樣量2μL。流動(dòng)相為甲醇（A）和0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸銨）（B），流速0.3 mL／min；梯度洗脫程序：0～2 min，80%B；2～7 min，80%B～5%B；7～9 min，5%B；9～9.1 min，5%B～80%B；9.1～12 min，80%B。

1.4 Q－TOF／MS質(zhì)譜條件

離子源：Dual AJS ESI源；掃描方式：正離子全掃描；全掃描范圍：50～1 000 Da；毛細(xì)管電壓：4 000 V；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12.0 L／min；干燥氣流速：16.0 L／min；干燥氣溫度：200℃；碎裂電壓：135 V。參比溶液中含嘌呤（C5H4N4，離子精確質(zhì) 量 數(shù) 為 121.050 873）和 HP－0921（C18H18O6N3P3F24，其離子精確質(zhì)量數(shù)為922.009 798）。

數(shù)據(jù)采集、定性處理和定量處理分別經(jīng)過Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition、Agilent MassHunter Qualitive Analysis（B.06.00）和Agilent MassHunter Quantitative Analysis軟件完成，抗抑郁類藥物數(shù)據(jù)庫通過Agilent MassHunter PCDL Manager建立。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC－Q－TOF／MS分離條件的選擇

考察了Eclipse Plus C18色譜柱和Extend C18色譜柱對(duì)抗抑郁類藥物的分離效果。結(jié)果表明，Extend C18色譜柱分離效果差，峰重合較多；而使用Eclips Plus C18色譜柱時(shí)，目標(biāo)物分離較好，且峰形對(duì)稱，這主要是因?yàn)樵撝鶎?duì)堿性化合物具有較高的分離度和出色的峰形。

實(shí)驗(yàn)中比較了0.2%甲酸水溶液－甲醇、0.2%甲酸水溶液－乙腈、0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸銨）－甲醇和0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸銨）－乙腈4種流動(dòng)相體系對(duì)分離效果的影響。選用甲醇作為有機(jī)相時(shí)峰形較好且分離效果較佳。在水相中添加5 mmol／L甲酸銨可以抑制抗抑郁類藥物在離子源中生成［M＋Na］＋峰，雖然背景值有所升高，但目標(biāo)物的信號(hào)顯著增強(qiáng)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。因此，本研究選用0.2%甲酸水溶液（含5 mmol／L甲酸銨）－甲醇體系作為流動(dòng)相，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了流動(dòng)相梯度洗脫條件。梯度起始時(shí)選用80%B有利于洗脫血液中的極性基質(zhì)，減少樣品中目標(biāo)物電離時(shí)的基質(zhì)干擾。目標(biāo)物的色譜圖如圖2所示，在流動(dòng)相梯度洗脫條件下，目標(biāo)物分離較好且峰形對(duì)稱，能夠滿足質(zhì)譜檢測(cè)的要求。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 前處理方式的選擇

本研究比較了固相萃取和液液提取對(duì)血液樣品中目標(biāo)物提取回收率的影響。由表1可見，固相萃取相對(duì)液液提取的回收率更高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。同時(shí)，固相萃取分離純化效果更好，雜質(zhì)干擾少。

圖2 5種抗抑郁類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg／L）的色譜圖Fig.2 Chromatograms of a mixed solution of the five antidepressants（100μg／L）

表1 血液中5種抗抑郁類藥物的液液提取和固相萃取的回收率（n＝6）Table 1 Extraction recoveries of the five antidepressants spiked in blood cleaned up by liquid－liquid extraction（LLE）and solid phase extraction（SPE）（n＝6）

2.2.2 樣品pH 的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了樣品的pH對(duì)固相萃取回收率的影響。樣品的pH分別為3、5、7、9和11時(shí)的回收率見圖3。在pH為9和11時(shí)固相萃取回收率相差較小，且明顯高于酸性條件下的回收率，考慮到堿性太強(qiáng)時(shí)目標(biāo)物容易分解，且血液容易凝固，不利于目標(biāo)物的提取，因此選擇樣品的pH為9。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖3 血液中5種抗抑郁類藥物在不同pH時(shí)的固相萃取回收率Fig.3 Extraction recoveries of the five antidepressants in blood extracted by SPE under different pH conditions

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的共提取干擾物影響目標(biāo)物的離子化，從而使目標(biāo)物的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或抑制。因此，需要對(duì)目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果選擇適合的方法抵消基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的偏差［24］。本研究中采用空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積除以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜峰面積得到的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect）。選擇10、100、500μg／L 3個(gè)添加水平，按照1.2節(jié)中固相萃取方法測(cè)定6次。結(jié)果（見表2）表明目標(biāo)物的基質(zhì)抑制效應(yīng)程度均較大，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在沒有目標(biāo)物對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的情況下，必須使用基質(zhì)匹配外標(biāo)校準(zhǔn)曲線才能對(duì)血液中的目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

表2 血液中5種抗抑郁類藥物的基質(zhì)效應(yīng)（n＝6）Table 2 Matrix effects of the five antidepressants in blood（n＝6）

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性方程及檢出限

在優(yōu)化條件下，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，考察了目標(biāo)物在1～500μg／L范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。以定量離子的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。在1～500μg／L范圍內(nèi)，各目標(biāo)物均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997 6～0.999 7。

表3 5種抗抑郁類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Regression equations，correlation coefficients（r）and limits of detection （LODs）of the five antidepressants

2.4.2 回收率和精密度

取空白血分別加入10、100、500μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)中固相萃取處理后的色譜峰面積除以空白樣品基質(zhì)提取液添加相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積的比值計(jì)算回收率。每個(gè)添加濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和精密度（RSD）。由表4可見，目標(biāo)物的平均回收率在79.6%～96.4%之間，精密度范圍為4.1%～6.4%。

表4 血液中5種抗抑郁類藥物的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 4 Mean recoveries and RSDs of the five antidepressants spiked in blood（n＝6）

2.4.3 數(shù)據(jù)庫的建立及篩查

利用Agilent MassHunter PCDL Manager軟件建立目標(biāo)物數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包括目標(biāo)物的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和目標(biāo)物所有碎片離子信息。通過目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、同位素間距和保留時(shí)間對(duì)血液中抗抑郁類藥物進(jìn)行初篩，通過實(shí)際測(cè)定樣品的譜圖與譜庫中碎片離子信息的鏡像比對(duì)對(duì)抗抑郁類藥物進(jìn)行定性確認(rèn)。

利用建立的數(shù)據(jù)庫對(duì)某加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)試，通過軟件自動(dòng)比對(duì)實(shí)測(cè)樣品和數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)物的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布以及碎片離子信息匹配度等信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確篩查，結(jié)果見表5。在所設(shè)定的嚴(yán)格篩查條件下，所添加的抗抑郁類藥物能夠全部被檢測(cè)出來，且保留時(shí)間偏差全部小于0.1 min，質(zhì)量偏差小于1 mDa，MS匹配得分、同位素豐度匹配得分和同位素間距得分均大于95；卡馬西平、米氮平、阿米替林和多慮平的MS／MS匹配得分均大于70，但氯氮平的二級(jí)圖譜匹配得分只有53.13，不能達(dá)到70分的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)［24］。這主要是因?yàn)楦蓴_離子m／z 270.079 2響應(yīng)太高，導(dǎo)致同位素峰m／z 271、272匹配較差，因此得分偏低。

在氯氮平數(shù)據(jù)處理過程中對(duì)干擾離子m／z 270.079 2進(jìn)行手動(dòng)背景扣除，得分可達(dá)到90.97，由圖4可以明顯看出，采用背景扣除提高了碎片離子的匹配度，進(jìn)而大大提高了MS／MS匹配得分，因此認(rèn)為氯氮平被檢出并得到了確認(rèn)。

2.5 實(shí)際樣品分析

利用本研究建立的LC－Q－TOF／MS抗抑郁類藥物數(shù)據(jù)庫快速篩查確證技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室一起毒化案件樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。2014年2月，重慶某區(qū)居民張某在賓館被麻醉強(qiáng)奸，于第二日早上在賓館發(fā)現(xiàn)顆粒狀固體，提取張某靜脈血和顆粒狀固體進(jìn)行檢驗(yàn)，在血液中篩查出阿米替林、卡馬西平和多慮平，同時(shí)在顆粒狀固體中檢出卡馬西平和多慮平。

表5 利用Agilent MassHunter PCDL Manager軟件對(duì)加標(biāo)樣品中5種抗抑郁類藥物的篩查結(jié)果Table 5 Screening results of the five antidepressants spiked in blood using Agilent MassHunter PCDL Manager software

圖4 血液樣品中氯氮平（a）扣除背景前和（b）扣除背景后碎片離子鏡像信息的對(duì)比圖Fig.4 Spectral difference（a）before and（b）after background subtraction of clozapine in blood

采用基質(zhì)匹配外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)篩查出的抗抑郁類藥物進(jìn)行定量，結(jié)果血液中阿米替林、卡馬西平和多慮平的質(zhì)量濃度分別為296.6、189.6和102.3 μg／L。該結(jié)論為案件性質(zhì)的判定提供了重要依據(jù)。

3 結(jié)論

本文采用自動(dòng)固相萃取方法對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，并建立了目標(biāo)物數(shù)據(jù)庫。利用LC－Q－TOF／MS數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行定性分析，利用基質(zhì)匹配外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)際樣品中抗抑郁類藥物的篩查、確證與定量，并取得了令人滿意的結(jié)果。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，在法庭科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中具有重要的實(shí)際意義。

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