木曉麗， 張 潔， 彭思遠(yuǎn)， 王曉雪， 申河清

（中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所，城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén)361021）

表觀遺傳學(xué)研究基因表達(dá)在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下進(jìn)行的可遺傳性變化。DNA甲基化是研究最為廣泛的表觀遺傳修飾，胞嘧啶在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成 5－甲基胞嘧啶（5－methylcytidine，5mC）。異常的DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象改變，最終抑制基因轉(zhuǎn)錄，改變基因表達(dá)量和活性；同時(shí)，還會(huì)影響細(xì)胞的增殖和分化，并與癌癥的誘發(fā)有著密切的聯(lián)系［1－4］。繼胞嘧啶的5－甲基修飾形式之后，被稱為第6個(gè)堿基的5－羥甲基胞嘧啶（5－h(huán)ydroxymethylcytosine，5hmC）作為又一重要的表觀遺傳修飾受到廣泛關(guān)注。甲基胞嘧啶雙加氧酶（ten－eleven translocation，tet）可將羥基轉(zhuǎn)移到5mC上形成5hmC。5hmC被認(rèn)為是DNA去甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，羥甲基化DNA具有參與基因表達(dá)調(diào)控的潛在功能，同時(shí)5hmC可以通過(guò)多種途徑重新轉(zhuǎn)化成未修飾胞嘧啶，修復(fù)異常的DNA甲基化［5，6］。準(zhǔn)確測(cè)定全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平對(duì)于研究疾病機(jī)理和環(huán)境污染物健康效應(yīng)具有重要的作用。

全基因組整體甲基化水平的分析方法主要包括SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法、氯乙醛法、免疫化學(xué)法和高效液相色譜及相關(guān)方法。作為最早發(fā)展的方法，SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法由于酶不穩(wěn)定導(dǎo)致結(jié)果不夠精確［7］。氯乙醛反應(yīng)法具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，但是操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且氯乙醛為有毒物質(zhì)［8］。免疫化學(xué)法可以對(duì)DNA甲基化和羥甲基化水平進(jìn)行測(cè)定，但是由于使用特異性抗體，檢測(cè)成本較高。近年來(lái)，高效液相色譜成為基因組整體水平DNA甲基化水平的主流檢測(cè)方法［9］。但是受紫外檢測(cè)器本身靈敏度的限制，該法對(duì)于DNA含量較低的生物樣品的分析不夠理想。除此以外，高效毛細(xì)管電泳法、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序方法和酶區(qū)甲基化分析方法也被應(yīng)用于全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平的檢測(cè)［9－12］。最近的研究發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)5hmC的含量非常低［13］，而且存在多種不同基團(tuán)修飾的胞嘧啶［5］，酶學(xué)方法和亞硫酸鹽處理等技術(shù)不能區(qū)分不同基團(tuán)修飾的胞嘧啶，亟待發(fā)展可以同時(shí)高效、準(zhǔn)確測(cè)定5mC和5hmC的檢測(cè)方法。我們最近采用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)器，測(cè)定了細(xì)胞系和血漿、精子樣本的全基因組DNA甲基化率［14］。本研究在以前的基礎(chǔ)上改進(jìn)了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，可同時(shí)定量測(cè)定5mC和5hmC，并應(yīng)用于研究砷暴露大鼠全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平。該方法快速簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性好，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，能夠滿足生物樣品中5mC和5hmC定量分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UltimateTMLC－液相色譜（Dionex，美國(guó)）；5500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜（ABI，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio－RAD，美國(guó)）；kinetex?core－shell C18柱（Phenomenex，美國(guó)）；恒溫水浴鍋（上海梅香儀器，中國(guó)）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Hettich，德國(guó)）；ND－1000超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop，美國(guó)）；80℃超低溫冰箱（海爾，中國(guó)）；Milli－Q 超純水處理系統(tǒng)（Pall，美國(guó)）；微量移液器（10、20、100、200、1 000、5 000μL）（Eppendorf，德國(guó)）。亞砷酸鈉（NaAsO2，分析純，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，中國(guó)）；DNA提取試劑盒（DNeasy Blood ＆ Tissue Kit，QIAGEN，德 國(guó)）；RNase A （天根生化，中國(guó)）；DNaseⅠ（RNasefree）、FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase、ExonucleaseⅠ（Fermentas，加拿大）；5－甲基脫氧胞嘧啶核苷（2′－deoxy－5－methylcytidine，5mdC，東京仁成工業(yè)株式會(huì)社，日本）；脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷（deoxyguanosine，dG，百靈威，中國(guó)）；5－甲基脫氧胞 嘧 啶 DNA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 （5－Methylcytosine ＆ 5－Hydroxymethylcytosine DNA Standard，Zymo Research，美國(guó)）；甲醇（色譜純，Honeywell，美國(guó)）。

1.2 動(dòng)物暴露實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)健康Sprague Dawley雄性大鼠30只（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體重為（200±10）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠隨機(jī)分組編號(hào)：對(duì)照組為6只，暴露組為8只。暴露組飲水中亞砷酸鈉的質(zhì)量濃度分別為2 mg／L。動(dòng)物每日經(jīng)自然飲水連續(xù)暴露染毒，持續(xù)9周。大鼠每日給予充足飲水和食物，并記錄每日飲水消耗量，每7天測(cè)量1次體重。9周后進(jìn)行取材。使大鼠吸入乙醚麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)，對(duì)其進(jìn)行解剖，取其肝臟和小腦，至于－80℃保存待用。

1.3 DNA的提取和酶解

取保存于－80℃的肝臟和小腦樣品，置于－20℃半小時(shí)，而后于4℃對(duì)樣品進(jìn)行退凍。稱取適量的樣品，采用DNA提取試劑盒提取DNA，流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為避免RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在提取過(guò)程中加入RNase A，并在提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取結(jié)果。利用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度。DNA的酶解參照文獻(xiàn)［14，15］報(bào)道的方法。根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，取1μg DNA樣品于100℃水浴中加熱3 min，然后冰浴10 min，加入1／10體積的0.1 mol／L醋酸銨溶液（pH7.5）；加入2 units DNaseⅠ，于37℃水浴中孵育3 h；然后加入2 units Alkaline Phosphatase，于37℃水浴中孵育3 h；最后加入40 units ExonucleaseⅠ，于37℃水浴中孵育過(guò)夜保證DNA酶解完全。酶解后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶解效果。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取1 mg 5mdC和dG；用超純水定容并稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。5mdC的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.05、0.25、0.40、1.00和5.00 ng／mL，dG的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為1、5、10和20 ng／mL。5－羥甲基脫氧胞嘧啶DNA標(biāo)準(zhǔn)品為897 bp的DNA片段，其中的胞嘧啶已全部經(jīng)過(guò)處理，轉(zhuǎn)化為5－羥甲基脫氧胞嘧啶（5hmdC）。取5－羥甲基脫氧胞嘧啶DNA標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其進(jìn)行與提取DNA相同的酶解過(guò)程，用超純水定容并稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度為0.004 5、0.022 4、0.044 8和0.224 0 ng／mL。

1.5 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

液相色譜條件：Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm，美國(guó)Phenomenex公司）；流速0.3 mL／min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min，3%B；5～6 min，5%B升至100%B；6～7.5 min，維持100%B；7.5～7.51 min，100%B降至5%B；7.51～10 min，維持3%B。

串聯(lián)質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度（TEM）550℃；碰撞氣（CAD，N2）Medium；氣簾氣（CUR，N2）30 L／min；霧化氣（GS1）55 L／h；輔助加熱氣（GS2）50 L／h；駐留時(shí)間20 ms；入口電壓（EP）10 V；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）詳見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Operating parameters of mass spectrometry

圖1 （a）脫氧甲基胞嘧啶核苷、（b）脫氧羥甲基胞嘧啶核苷和（c）脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷的標(biāo)準(zhǔn)品典型色譜圖、（d）大鼠小腦組織樣品的色譜圖和（e）大鼠肝臟樣品的色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of（a）deoxy－5－methylcytidine（5 mdC），（b）deoxy－5－h(huán)ydroxymethylcytidine（5hmdC），（c）deoxyguanosine（dG）standard samples，（d）DNA sample of rat cerebellum，（e）DNA sample of rat liver

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。大鼠對(duì)照組和暴露組中組織樣品的DNA甲基化水平和羥甲基化水平采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究比較了乙腈和甲醇作為流動(dòng)相的分離能力。dG、5mdC和5hmdC均屬于強(qiáng)極性化合物，在C18柱上保留較弱。由于乙腈的洗脫能力強(qiáng)于甲醇，即使在低濃度下也無(wú)法對(duì)這些化合物進(jìn)行基線分離。我們還考察了甲酸、乙酸銨等添加劑對(duì)分離和檢測(cè)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些添加劑并沒(méi)有顯著的改善分離和檢測(cè)靈敏度。因此，選擇甲醇作為流動(dòng)相。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫條件，dG、5mdC和5hmdC可在4 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，如圖1a～c所示。我們分別對(duì)3種核苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，并優(yōu)化各分子離子的去簇電壓。然后分別以上述離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩對(duì)子離子為定性離子，豐度最高的作為定量離子，然后優(yōu)化其碰撞能量，使得分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳。

2.2 計(jì)算方法的優(yōu)化

生物DNA樣品中胞嘧啶（5mC、5hmC和G）的水平與脫氧胞嘧啶（5mdC、5hmdC和dG）相等，因此，我們通過(guò)測(cè)定3種脫氧胞嘧啶從而確定胞嘧啶的水平。按實(shí)驗(yàn)方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5mdC、5hmdC和dG的濃度，并根據(jù)下式計(jì)算全基因組的DNA甲基化率（MR）和羥甲基化率（HMR）：

報(bào)道的全基因組DNA甲基化率的計(jì)算公式為：MR＝100%×（5mdC／（5mdC＋dC））［14－16］。但是胞嘧啶存在多種修飾形式，甲基修飾只是其中一種［5］，因此此計(jì)算公式存在一定的誤差。鳥(niǎo)嘌呤與不同形式的胞嘧啶進(jìn)行配對(duì)，而且其結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因此本研究中對(duì)計(jì)算公式進(jìn)行了修正。，5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷的LOD和LOQ分別為0.001和0.003 ng／mL，脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷的LOD和LOQ分別為0.2和0.6 ng／mL。

2.3 檢出限與定量限

逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，以信噪比為3和10的要求確定5－甲基脫氧胞嘧啶核苷的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為 0.015 和 0.045 ng／mL，5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷的LOD和LOQ分別為0.001和0.003 ng／mL，脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷的LOD和LOQ分別為0.2和0.6 ng／mL。

2.4 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線與回收率

配制0.1、0.8和2.5 ng／mL的5－甲基脫氧胞嘧啶核苷溶液，0.5、2.5、10 ng／mL脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷溶液，0.01、0.05和0.2 ng／mL的5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷溶液。每個(gè)濃度均配制5份，依照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 方法應(yīng)用

大量流行病學(xué)、動(dòng)物暴露和細(xì)胞暴露研究表明砷暴露會(huì)顯著影響生物體的全基因組DNA甲基化修飾。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)砷暴露濃度與全基因組DNA甲基化水平變化在大部分研究中都不是呈單調(diào)的線性關(guān)系，動(dòng)物暴露實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象主要集中于肝臟，而且在不同物種和不同的暴露濃度得到的全基因組DNA甲基化水平的變化趨勢(shì)存在差異，不同的細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)中也得到不同結(jié)論［17，18］。精確的檢測(cè)方法是進(jìn)一步研究砷對(duì)DNA甲基化水平的影響的基礎(chǔ)。在本研究中對(duì)大鼠砷暴露濃度為2 mg／L，暴露9周，取其肝臟和小腦按照上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定5mdC、5hmdC和dG，并計(jì)算全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平。典型色譜圖見(jiàn)圖1d～e，動(dòng)物組織樣品檢測(cè)結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果表明砷暴露導(dǎo)致小腦和肝臟中全基因組DNA甲基化率顯著升高，而全基因組DNA羥甲基化率未發(fā)生顯著變化。小腦和肝臟的全基因組DNA甲基化率水平接近，維持在4%～6%之間；而全基因組DNA羥甲基化率在兩個(gè)組織中差異較大，小腦中的水平超過(guò)了肝臟的3倍以上。

表2 脫氧甲基胞嘧啶核苷、脫氧羥甲基胞嘧啶核苷和脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及回收率Table 2 Linear equations，correlation coefficients（R2）and recoveries of deoxy－5－methylcytidine，deoxy－5－h(huán)ydroxymethylcytidine and deoxyguanosine

圖2 砷暴露大鼠肝臟和小腦全基因組DNA甲基化率的變化Fig.2 Changes of global DNA methylation ratio of liver and cerebellum in rat after arsenic exposure

圖3 砷暴露大鼠肝臟和小腦全基因組DNA羥甲基化率的變化Fig.3 Changes of global DNA hydroxymethylation ratio of liver and cerebellum in rat after arsenic exposure

3 結(jié)論

本研究基于液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜，建立了同時(shí)檢測(cè)生物樣品中全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平的分析方法。5mdC和5hmdC的檢出限和定量限明顯優(yōu)于之前的研究報(bào)道［14，16］。通過(guò)分析大鼠肝臟和小腦中全基因組DNA甲基化率和羥甲基化率表明該方法具有良好的重現(xiàn)性、靈敏度和穩(wěn)定性。這也為今后同時(shí)研究DNA甲基化和羥甲基化提供了有力的支持。

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