鐘海雷，李妍伸,杜彬彬,邢清和,賀 林,張彥周

(1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院發(fā)育生物學(xué)與出生缺陷研究所,上海 200032; 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,鄭州 450052)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一種以常染色體顯性遺傳為主要方式的遺傳性心肌病，通常以左心室(或)右心室不對(duì)稱肥厚、心肌纖維肥大、排列紊亂為病理特征，是青少年尤其是35歲以下運(yùn)動(dòng)員猝死的首要原因[1]。其中，左心室流出道在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)梗阻的稱為肥厚型梗阻性心肌病(hypertrophic obstructive cardiomyopathy,HOCM)。肥厚型心肌病的發(fā)病率約為1/500，其中50%～70%具有明顯的家族聚集傾向，稱之為家族性肥厚型心肌病(familial hypertrophic cardiomyopathy，F(xiàn)HCM)[2]。到目前為止，通過心電圖、超聲心動(dòng)圖及血流動(dòng)力學(xué)檢查尚不能預(yù)測(cè)心臟性猝死的發(fā)生。因上述方法只有在心肌組織出現(xiàn)不可逆病理改變后方可奏效，而許多患者表現(xiàn)為平時(shí)無癥狀或首發(fā)癥狀就是猝死，若能在早期(不可逆病理改變之前)便做出診斷，則對(duì)于發(fā)現(xiàn)患者并防止不可逆病理改變及猝死的發(fā)生具有重大意義[3]。通過基因檢測(cè)，可以做到早期診斷該病，特異性也高達(dá)99.9%，但因目前能夠找出突變基因的HCM患者僅占總HCM患者的60%～70%[4]，且發(fā)現(xiàn)的與HCM相關(guān)的基因至少已有14個(gè)，這些都降低了基因檢測(cè)在HCM診斷上的敏感性(約為50%～70%)[5]。然而近幾年全外顯子組測(cè)序的出現(xiàn)，為HCM的診斷及研究提供了新的技術(shù)手段，在成本相對(duì)較低的情況下大大加快了研究進(jìn)度[6]。因此，本文利用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)一例HOCM患者進(jìn)行突變位點(diǎn)篩查，并通過Sanger測(cè)序進(jìn)行家系成員驗(yàn)證，以期快速找到與該家系病癥相關(guān)的突變位點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 中國河南省一肥厚型梗阻性心肌病家系(如圖1所示)，其中先證者(2號(hào))64歲，2012年起出現(xiàn)胸悶、呼吸困難，暈厥癥狀。彩超報(bào)告顯示其左室壁非均勻性增厚，以室間隔為著，最厚處25 mm，室間隔突向左室流道出道，致左室流出道狹窄，內(nèi)徑14 mm。增厚室壁心肌回聲增粗增強(qiáng)，搏動(dòng)僵硬，余室壁波動(dòng)幅度在正常范圍，診斷為肥厚型梗阻性心肌病。先證者有3個(gè)兒子(3～5號(hào))，均曾檢查出有病，先證者的丈夫(1號(hào))為正常人。HCM診斷依據(jù)WHO/國際心臟病學(xué)會(huì)和協(xié)會(huì)ISFC 1996年公布的標(biāo)準(zhǔn)：超聲心動(dòng)圖檢查室間隔或心室壁厚度≥13 mm，排除高血壓主動(dòng)脈瓣狹窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)倫理委員會(huì)同意，提供外周血樣本的家系成員(1～3號(hào))均簽署了知情同意書。

圖1 突變家系系譜圖

1. 2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用荷蘭QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取該家系1～3號(hào)樣本外周血白細(xì)胞中的DNA，經(jīng)NanoDrop 1000和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA純度和濃度符合要求后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外顯子測(cè)序文庫制備 將3號(hào)樣本的基因組DNA超聲打斷、純化，根據(jù)New England Biolabs公司DNA Library Preparation Kit試劑盒說明書制備DNA文庫，Qubit質(zhì)檢合格后與捕獲探針雜交，進(jìn)一步純化后，得到外顯子測(cè)序文庫。

1.2.3 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析 在Illumina-Hiseq2000平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序，得到的原始序列文件用Fastqc軟件檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量，用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)程序?qū)π蛄形募腿祟悈⒖蓟蚪M(hg19版)進(jìn)行比對(duì)，用Genome Analysis Tool Kit (GATK)工具輸出指定基因上的突變位點(diǎn)，并用Annovar軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋。

1.2.4 篩選的致病位點(diǎn)區(qū)域PCR擴(kuò)增 根據(jù)全外顯子組測(cè)序中找到的突變位點(diǎn)及基因名，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的已知相關(guān)基因(如MYH7、MYH6、MYBPC3等)，篩選得到感興趣的突變位點(diǎn)chr14:23901922 (c.G428A; p.R143Q)，在GenBank數(shù)據(jù)庫上獲取突變位點(diǎn)上下各200 bp的序列，采用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3設(shè)計(jì)引物如下：上游引物序列為5’-ACTGGCAAGTCACTGCTCCT-3’；下游為5’-CTCCCTTCCTTCTCCCTCTC-3’。以1～3號(hào)樣本基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增選用50 μl的反應(yīng)體系：DNA模板10 ng；2×Taq PCR Master Mix(上海萊楓生物科技有限公司)25 μl；Primer F/R(10 μM)各1μl；滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μl。使用Gene Amp? 9700 PCR儀，反應(yīng)程序如下：94℃解鏈5 min，94℃變性30 s，60.5℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃存放。

1.2.5 測(cè)序分析 PCR產(chǎn)物純化后均用雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序(美國ABI公司3730XL測(cè)序儀)，測(cè)序單向引物與PCR擴(kuò)增引物相同。

2 結(jié) 果

2.1 全外顯子組測(cè)序結(jié)果分析 通過CASAVA 1.8軟件獲得序列文件(7.23Gb)，GATK輸出突變位點(diǎn)原始數(shù)據(jù)大小為36.96 Mb，平均63.1的覆蓋倍數(shù)，其中覆蓋倍數(shù)在10倍以上的堿基平均占總數(shù)的93%，20倍以上的占總數(shù)的83%，測(cè)序效果良好。

2.2 突變位點(diǎn)篩查結(jié)果 結(jié)合全外顯子組測(cè)序的結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道的已知與HCM相關(guān)的基因，篩選到一個(gè)位于MYH7基因第5號(hào)外顯子上的非同義突變：chr14:23901922 (c.G428A; p.R143Q)。家系成員(圖1中1～3號(hào))致病位點(diǎn)區(qū)域PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序的結(jié)果顯示2號(hào)患者(先證者)、3號(hào)患者(先證者大兒子)均存在Arg143Gln突變，而1號(hào)正常人(先證者丈夫)未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變(如圖2所示)。

3 討 論

目前的研究報(bào)道指出編碼β肌球蛋白重鏈的MYH7是肥厚型心肌病最主要的致病基因，其突變引起的HCM約占總數(shù)的30%～50%，該基因定位于14號(hào)染色體長臂區(qū)域(14q12)，其編碼的β肌球蛋白分為球狀頭部區(qū)S1、頸部區(qū)S2和桿狀尾部區(qū)，頭部區(qū)S1包含ATP酶活性位點(diǎn)和與肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，是肌球蛋白的重要功能區(qū)[7](圖3，表1)。

圖2 MYH7基因突變家系第5號(hào)外顯子核苷酸編碼序列428位置測(cè)序結(jié)果

圖3 β肌球蛋白結(jié)構(gòu)

表1不同物種MYH7部分氨基酸序列同源對(duì)比

物種氨基酸序列人YTPEVVAAYRGKKRSEA獼猴YNAEVVAAYRGKKRSEA貓YNAEVVAAYRGKKRSEA鼠YNAEVVAAYRGKKRSEA雞YNAEVVAAYRGKKRTEV斑馬魚YNQEVVVAYRGKKRSEA

本研究在中國河南省一家系中發(fā)現(xiàn)的MYH7基因Arg143Gln突變正位于球狀頭部區(qū)，造成了帶正電荷的精氨酸轉(zhuǎn)換為中性的谷氨酰胺。利用Mutation tuster在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行該位點(diǎn)物種間同源性比對(duì),結(jié)果顯示該突變位點(diǎn)所編碼的精氨酸在物種間高度保守(表1黑框所示),顯示其重要的生物學(xué)意義。

該突變最早是2001年由東京醫(yī)科齒科大學(xué)Kimura等[8]在東亞人群中進(jìn)行肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌病基因突變研究時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。在2010年Kimura[9]認(rèn)為該位點(diǎn)突變雖然造成了電荷變化，但不在重要功能區(qū)域，70歲以上患者的存活率在93%以上，因此將該突變位點(diǎn)定性為溫和性突變。

我們用BLASTP找到了與MYH7編碼的β肌球蛋白重鏈氨基酸序列同源性達(dá)到98%的4DB1蛋白結(jié)構(gòu)文件，并用分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件PyMOL對(duì)該蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。與β肌球蛋白重鏈蛋白一樣，4DB1蛋白也是由A、B兩條鏈組成二聚體(如圖4-A所示)，而Arg143位于二聚體的結(jié)合界面上，突變后可能影響二聚體的結(jié)合。而4DB1-A鏈局部結(jié)構(gòu)顯示，突變位點(diǎn)Arg143與ATP的距離為20A (2 nm)，超出了結(jié)合口袋范圍(與ATP距離<10 A)，因此該位點(diǎn)不在ATP酶活性區(qū)域，與Kimura 2010年綜述中的觀點(diǎn)相符。

圖4 4DB1 A 在PyMOL下視圖

此外北京阜外心血管病醫(yī)院的宋雷等[10]及北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的邵春麗[11]在152例中國肥厚型心肌病患者中共發(fā)現(xiàn)5例Arg143Gln突變，頻率較高，提示該位點(diǎn)是中國人中的突變熱點(diǎn)，其中邵春麗報(bào)道的2位攜帶Ala26Val和Arg143Gln雙雜合突變的患者出現(xiàn)反復(fù)黑朦或暈厥，紐約心功能為Ⅲ級(jí)，癥狀較Arg143Gln單突變明顯嚴(yán)重。另外攜帶有Gly716Arg，Asp778Gly等惡性突變的患者臨床癥狀更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為高外顯率、高猝死率、預(yù)后差的特點(diǎn)[9]。不同突變位點(diǎn)所致臨床表型的差異性表明深入分析突變型與表型的關(guān)系對(duì)判斷患者的預(yù)后以及提前給予預(yù)防性治療措施，延緩疾病進(jìn)程都具有非常重要的意義，也是開展HCM臨床基因診斷和基因治療的首要步驟。

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