王婷婷，鄭梅玲，王治鴻，賀江梅，張桂林，化愛玲

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院計劃生育研究室，太原 030001)

復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，除外已知原因，目前仍有50%的復發(fā)性流產(chǎn)原因不明，是臨床預防和治療的難點。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、血管內(nèi)皮生長因子(endothelial factor,VEGF)有促進血管生成的作用，本研究通過探討兩個因子對母胎界面血管生成的作用，以了解復發(fā)性流產(chǎn)的可能發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自2012年7月至2013年7月間來我院婦產(chǎn)科門診就診的復發(fā)性流產(chǎn)患者25例作為病例組，既往均有2次或2次以上自然流產(chǎn)史，除外夫婦雙方染色體異常，生殖器解剖畸形，免疫因素，病毒感染，內(nèi)分泌異常，男方精液異常等因素。選自同一時期來我院行人工流產(chǎn)自愿終止妊娠的正常健康早孕婦女25例作為對照組，既往有正常分娩史，無自然流產(chǎn)史，B型超聲檢查提示胚胎有胚芽及原始心管搏動。兩組妊娠婦女年齡20～34歲，孕周6～12周，年齡及孕周的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 外周血中NGF、VEGF濃度的測定 采集兩組妊娠婦女空腹外周靜脈血2 ml，離心后取血清，將血清置于-20℃冰箱保存，使用時統(tǒng)一解凍，應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定NGF、VEGF在血清中的濃度(單位：pg/ml)，操作步驟按試劑盒(購自武漢博士德生物技術公司)說明書進行,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值(OD),通過繪制標準曲線求出血清中NGF、VEGF的濃度。

1.3 絨毛、蛻膜組織中NGF、VEGF蛋白表達量的檢測 收集兩組妊娠婦女人工流產(chǎn)后新鮮的絨毛及蛻膜組織，生理鹽水反復沖洗，去掉血液后，10%甲醛固定24 h，石蠟包埋甲醛固定后的絨毛、蛻膜組織，連續(xù)切片，厚1.5 μm,應用免疫組織化學法檢測絨毛及蛻膜組織中NGF、VEGF的蛋白表達量，操作步驟按試劑盒(購自武漢博士德生物技術公司)說明書進行。 結果判讀：光學顯微鏡下觀察細胞漿內(nèi)有淡黃、黃色、棕黃色顆粒沉著為陽性表達，每張切片(放大400×)隨機選擇5個不重疊的視野，測定每個視野的陽性表達的平均灰光度值(注：平均灰光度值與蛋白表達量呈反比)。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所測數(shù)據(jù)以χ2表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，相關資料采用Pearson相關分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 絨毛、蛻膜組織中NGF、VEGF的表達 免疫組化染色結果表明，在病例組、對照組的絨毛、蛻膜細胞漿內(nèi)NGF、VEGF陽性顆粒，結果見圖1。

2.2 外周血中NGF、VEGF蛋白的濃度 病例組絨毛、蛻膜組織中的NGF、VEGF蛋白表達量及在外周血中的濃度均低于對照組，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，結果見表1，表2。

2.3 NGF、VEGF在兩組妊娠婦女絨毛、蛻膜組織及血清中的相關性分析 NGF、VEGF在病例組、對照組血清中的水平呈正相關(r1=0.965, r2=0.733,P均<0.05), 絨毛及蛻膜組織中的表達不存在相關性(r3=0.378, r4=-0.049, r5=0.542, r6=-0.175 ,P均>0.05)。

圖1 絨毛、絨毛中NGF和VEGF的表達

A: 流產(chǎn)組絨毛中NGF的表達,×250; B: 對照組絨毛中NGF的表達,×250; C: 流產(chǎn)組蛻膜中NGF的表達,×100; D: 對照組蛻膜中NGF的表達,×100; E: 流產(chǎn)組絨毛中VEGF的表達,×250; F: 對照組絨毛中VEGF的表達,×250; G: 流產(chǎn)組蛻膜中VEGF的表達,×100; H: 對照組蛻膜中VEGF的表達,×100

表1 NGF、VEGF在兩組妊娠婦女絨毛、蛻膜組織中的平均灰光度值(OD)比較

表2 NGF在兩組妊娠婦女血清中的濃度比較 (pg/ml)

3 討 論

胎盤是胎兒與母體進行物質交換的器官，所以胎盤良好的生長與發(fā)育是成功妊娠的關鍵。在胎盤形成和植入的過程中，有豐富的血管生成。研究表明，許多不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與胎盤組織中血管增生不平衡和胎兒血液供應不足有密切關系。

神經(jīng)生長因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，主要功能是促進神經(jīng)細胞的生成和增殖，參與中樞及周圍神經(jīng)的生長發(fā)育，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，NGF可通過VEGF的表達而間接地促進血管生成，甚至認為NGF具有直接促進血管生成的作用，而將NGF稱為血管誘導因子，并認為其促進血管生成的作用優(yōu)于促進神經(jīng)再生的作用[1]。近年來，有文獻報道，NGF在大鼠角膜、小雞胚胎尿囊絨膜、缺血的小鼠內(nèi)收肌、肝癌、食管癌等非神經(jīng)器官和組織中具有血管生成作用。張果果等[2]通過免疫組化實驗證實，NGF有促進胚胎血管生成的作用，其在絨毛組織中表達降低，導致了流產(chǎn)的發(fā)生。本研究結果顯示，NGF在RSA患者絨毛、蛻膜組織中的表達及在血清中的水平顯著低于正常早孕者，提示NGF表達降低可能是導致RSA的原因。

血管內(nèi)皮生長因子屬血小板源性生長因子家族的一員， Zammiti等[3]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠受精卵VEGF的基因，小鼠胚胎血管完全缺如，最終導致胚胎死亡，可見在早期妊娠胚胎血管生成中，VEGF起關鍵作用。Rabban等[4]研究顯示：在受精卵植入期，VEGF在促進子宮內(nèi)膜血管的增生和維持血管的通透性方面起關鍵作用，在妊娠早期胎兒胎盤的生長和發(fā)育過程中，VEGF促進了胎盤部位的血管形成及分化，抑制VEGF的功能，導致胚胎著床失敗甚至胚胎死亡。本研究結果顯示，VEGF在RSA患者絨毛、蛻膜組織中的表達及在血清中的水平顯著低于正常早孕者，提示VEGF表達降低可能是導致RSA的原因。

張玉波等[5]用Wistar大鼠進行免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，不同劑量的NGF均能顯著促進再生坐骨神經(jīng)內(nèi)VEGF的表達和再生坐骨神經(jīng)內(nèi)血管生成，并隨著NGF給藥量的增加，VEGF的表達也隨之顯著增加，說明在促進再生坐骨神經(jīng)內(nèi)血管生成方面，NGF與VEGF呈正相關。Middeke等[6]對嗜鉻細胞瘤細胞系P12的研究和Calza等[7]對新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)的研究均證實，NGF、VEGF有促進血管生成的作用，且NGF與VEGF呈正相關。本研究結果顯示，NGF、VEGF在復發(fā)性流產(chǎn)組、正常妊娠組血清中的水平呈正相關，但在絨毛及蛻膜組織中的表達不存在相關性，可能與本實驗研究的樣本量小有關。

綜上所述，NGF、VEGF有促進胎盤血管形成的作用，NGF、VEGF表達降低可能是導致RSA的原因，但NGF、VEGF促進血管生成機制尚未完全闡明，有待進一步研究。

參考文獻

[1]Dechant G，Barde Y A.The neurotrophin receptor p75(NTR)：novel functions and implications for diseases of the nervous system[J].NatureNeurosei,2002,5(11):1131-1136.

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[3]Zammiti W,Mtiraoui N,Kallel C,etal. A case-control study on the association of idiopathic recurrent pregnancy loss with autoantibodies anaginst beta-glycoportein I and annexin V[J].Reproduction,2006,131(4):817-822.

[4]Rabbani M L,Rogers P A.Role of vascular endothelial growth factor in endometrial vascular events before inplantation in rats[J].Reproduction,2001,122(1)：85-90.

[5]張玉波,伍亞民,楊恒文,等.NGF促再生周圍神經(jīng)血管生成的實驗研究[J].中國矯形外科雜志,2005,13(18):1410-1412.

[6] Middede M,Hoffmann S,Hassan I,etal.In vitro and in vivo angigenesis in PC12 pheochromocytoma cells in mediated by vascular endothelial growth factor[J].ExpClinEndocrinolDiabetes,2002,110(8):386-392.

[7] Calza C L,Giardino L,Giuliani A,etal.Nerve growth factor control of neuronal expression of angiogenetic and vasoactive factors[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(7):4160-4165.