曹鳳娟 鄭唐春 趙思雯 代麗娟 曲冠證

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

小黑楊eIF5A2/4基因的克隆及其增強(qiáng)酵母對(duì)非生物脅迫抵抗能力1)

曹鳳娟 鄭唐春 趙思雯 代麗娟 曲冠證

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

利用PCR技術(shù)從小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)葉片cDNA中克隆到2個(gè)楊樹真核翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 5A)基因(eIF5A2/4)。利用雙酶切法分別構(gòu)建了含有eIF5A2/4的酵母表達(dá)載體pYES2-eIF5A2/4，轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc1，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和Northern blot鑒定，證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因菌株且經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后表達(dá)。通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因菌株和空載菌株在CdCl2、CuSO4、ZnSO4、NaCl、NaHCO3、山梨醇、H2O2脅迫下的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因菌株在以上非生物脅迫條件下的存活菌落數(shù)均高于非轉(zhuǎn)基因菌株，推測(cè)楊樹eIF5A2/4基因具有增強(qiáng)酵母菌對(duì)非生物脅迫抵抗力的功能。

小黑楊；eIF5A基因；酵母；非生物脅迫

Populussimonii×Populusnigra;eIF5A; Yeast; Abiotic stress

真核生物的翻譯起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A)(eIF5A，原名eIF-4D)，是一種高度保守的蛋白質(zhì)。它在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一含有hypusine殘基的蛋白質(zhì)，這種獨(dú)特的賴氨酸是翻譯后通過(guò)Nε-(4-氨基)賴氨酸合成酶和Nε-(4-氨基)賴氨酸水解酶的作用下形成的。每一個(gè)成熟的eIF5A僅含1個(gè)hypusine殘基，且eIF5A的hypusine修飾是其發(fā)揮功能、細(xì)胞存活和增殖所必須的[1-2]。eIF5A的功能主要是以蛋白質(zhì)合成起始功能為基礎(chǔ)，通過(guò)促進(jìn)一些特異mRNA的轉(zhuǎn)移及相關(guān)特異基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖或者細(xì)胞的衰老、死亡，或者產(chǎn)生環(huán)境脅迫的應(yīng)答和抵抗能力[3]。

從目前的研究來(lái)看，大多數(shù)的真核生物的翻譯起始因子5A(eIF5A)主要克隆自模式植物(如擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)[4])和其它甜土植物(如水稻(OryzasativaL.)[5]、玉米(ZeamaysL.)[6]、小麥(TriticumaestivumL.)[7]等)，而克隆自木本植物的eIF5A基因鮮有報(bào)道[8]。楊樹(Populusspp.)是世界上分布最廣、適應(yīng)性較強(qiáng)的樹種，同時(shí)也是非常重要的用材樹種，具有無(wú)性繁殖容易、生長(zhǎng)速度快、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展楊樹人工林是解決木材短缺的重要途徑之一。同時(shí)楊樹被作為木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物，是目前林木樹種遺傳轉(zhuǎn)化研究中的典型代表種[9]。小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)是中國(guó)林業(yè)科學(xué)院于1959年經(jīng)小葉楊和黑楊雜交而來(lái)。多年實(shí)踐證明小黑楊是速生豐產(chǎn)的好樹種，在生長(zhǎng)速度、抗寒、抗旱、抗病蟲害等優(yōu)良特性上均強(qiáng)于小葉楊和小青楊，特別在黑龍江省西部干旱、寒冷地區(qū)長(zhǎng)勢(shì)更好，10 a即可成為建筑材，可為我國(guó)北方沙荒、干旱地區(qū)優(yōu)良速生綠化樹種。目前對(duì)楊樹eIF5A基因的功能驗(yàn)證未見報(bào)道，本文以小黑楊為實(shí)驗(yàn)材料，克隆出來(lái)2個(gè)eIF5A同源基因，初步在酵母中驗(yàn)證了楊樹eIF5A基因在非生物脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)，以期為進(jìn)一步開展楊樹eIF5A的基因功能和蛋白質(zhì)的特性研究提供一定的操作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技有限公司；釀酒酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc1(His-,Leu-,Trp-,Ura-)及質(zhì)粒pYES2購(gòu)自Invitrogen公司；引物合成、測(cè)序由北京六合華大有限公司完成；PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix EX Taq Ⅱ等購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；酵母質(zhì)粒提取用酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；植物RNA快速提取試劑盒EasyPure Plant RNA Kit購(gòu)自北京全式金公司；Northern blot檢測(cè)相關(guān)試劑均購(gòu)自Roche公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小黑楊eIF5A基因克隆

用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取小黑楊組培苗的總RNA，檢測(cè)純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以單鏈cDNA為模板，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，送華大公司測(cè)序。

1.2.2 小黑楊eIF5A基因在楊樹中的組織表達(dá)特異性分析

在2012年9—10月份采取東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)小黑楊的成熟與衰老葉片，在2013年4—5月份采取小黑楊雄雌花序，用液氮冷凍處理并存放在-80 ℃，用于RNA的提取。

用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒分別提取小黑楊組培苗的根、莖、葉、幼苗及多年生小黑楊的成熟葉、雌雄花序的總RNA，檢測(cè)純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍，作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢驗(yàn)。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR premix ExTaq、引物(見表1)Primer-F(10 μmol/L)和Primer-R(10 μmol/L)各1、2 μL稀釋的各樣品的模板，加去離子水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)在OPTIONⅡ熒光定量PCR儀上完成。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性12 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；80 ℃讀板1 s，45次循環(huán)。用Actin基因作為內(nèi)參(見表1)，用2-△△CT方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析[10]。

1.2.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

根據(jù)表1中的引物擴(kuò)增目的基因，同時(shí)提取含有酵母表達(dá)載體pYES2的質(zhì)粒，用EcoR I、SacI內(nèi)切酶對(duì)目的基因及pYES2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段后，利用T4DNA連接酶連接后從而得到pYES2-eIF5A2/4酵母表達(dá)載體。提取質(zhì)粒送北京華大公司測(cè)序，驗(yàn)證是否將目的基因插入到酵母表達(dá)載體pYES2中。

1.2.4 酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1及Northern blot鑒定

按照Invitrogen公司的操作說(shuō)明，將質(zhì)粒pYES2和pYES2-eIF5A2/4轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，分別標(biāo)記為INVSc1(pYES2)和INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)。

在無(wú)菌條件下分別挑取INVSc1(pYES2)和INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)單菌落接種于SC-Ura培養(yǎng)基中，200 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h。測(cè)定培養(yǎng)物OD600值，取一定量的培養(yǎng)物，4 000 r/min，離心1 min，棄上清，菌體重懸于一定量的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-Ura+2%半乳糖)中使菌液OD600=0.4，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)36 h。參照Schmitt等[11]的方法提取酵母細(xì)胞總RNA。取10 μg總RNA，經(jīng)甲醛膠變性電泳并轉(zhuǎn)移到N+尼龍膜上，最后用紫外交聯(lián)儀處理(254 nm,8 min)。按照Roche公司的DIG Nucleic Acid Detection Kit使用說(shuō)明，以含有DIG標(biāo)記的dUTP為原料，利用PCR方法克隆eIF5A2/4基因作為探針，利用Northern blot方法檢測(cè)eIF5A2/4基因在酵母中的表達(dá)。

1.2.5 非生物脅迫處理

挑取重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)和對(duì)照酵母INVSc1(pYES2)單菌落，接種于SC-Ura液體培養(yǎng)基(以2%葡萄糖為碳源)中，30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h左右。

測(cè)定培養(yǎng)物OD600值，取一定量的培養(yǎng)物，4 000 r/min，離心1 min，棄上清，菌體重懸于10 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-Ura+2%半乳糖)中菌體OD600=0.4，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)36 h。

再測(cè)定培養(yǎng)物OD600值，取一定量的培養(yǎng)物，4 000 r/min，離心1 min，棄上清。菌體分別重懸于200 μL H2O、3 mmol/L CdCl2、0.2 mol/L CuSO4、0.2 mol/L ZnSO4、5% NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mol/L山梨醇、0.01% H2O2中，使得菌液OD600=2.0。上述5% NaCl和2 mol/L山梨醇處理24 h，其他脅迫分別處理2 h。

將菌液依次稀釋10、100、1 000、10 000、100 000倍后取3 μL接種于SC-Ura(2%葡萄糖為碳源)固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d左右，觀察菌落存活情況。

表1 PCR引物的名稱及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊eIF5A2/4基因的克隆

從小黑楊的葉片cDNA中克隆到2條eIF5A基因序列(圖1)，暫時(shí)命名為eIF5A2(GenBank No.KC521463)和eIF5A4(GenBank No.KC521464)。通過(guò)對(duì)核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這2條同源基因的開放閱讀框(ORF)均為483 bp，共預(yù)測(cè)編碼160個(gè)氨基酸。通過(guò)ExPASY網(wǎng)站(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)在線分析，預(yù)測(cè)2條同源基因編碼蛋白的分子量大約為17.5 kDa，等電點(diǎn)pI為5.60。

M.DNA marker DL5000；泳帶1.eIF5A2基因；泳帶3.eIF5A4基因；泳帶2,4.陰性對(duì)照。

圖1 小黑楊eIF5A2/4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 小黑楊eIF5A2/4基因的組織表達(dá)特異性

為了研究小黑楊eIF5A2/4的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)對(duì)楊樹不同的組織提取RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)eIF5A2、eIF5A4基因在不同的組織中表達(dá)差異。結(jié)果顯示，小黑楊eIF5A2基因在根和莖中的表達(dá)水平相對(duì)較低，而在雄花、雌花、莖尖、幼葉和老葉等組織中具有中等表達(dá)水平，而在成熟葉片中的表達(dá)水平最高(是根中含量的30倍)；小黑楊eIF5A4基因在不同組織的表達(dá)水平與eIF5A2基因比較類似，也是在根中的具有低水平表達(dá)，在成熟葉中具有高水平表達(dá)(表2)。

表2 小黑楊eIF5A2/4基因在的不同組織中相對(duì)表達(dá)水平

2.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

用EcoR I、SacI內(nèi)切酶對(duì)pYES2質(zhì)粒和基因片段進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段后，利用T4DNA連接酶連接后從而得到pYES2-eIF5A2/4重組子，分別挑取8個(gè)單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，獲得600 bp左右目的條帶(483 bp的外源基因片段+100 bp左右的載體片段)(圖2)。抽提質(zhì)粒送公司測(cè)序結(jié)果顯示，小黑楊eIF5A2/4基因分別整合到酵母表達(dá)載體pYES2中，未發(fā)生堿基突變，至此酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建完成。

2.4 轉(zhuǎn)eIF5A2/4基因酵母的Northern blot檢測(cè)

根據(jù)TE/LiAc法制備INVSc1酵母感受態(tài)，采用PEG/LiAc法將酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)中，涂布SC/-Ura平板上篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)獲得的重組酵母經(jīng)初步檢測(cè)后，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-Ura+2%半乳糖)誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。分別提取重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)抑制培養(yǎng)36 h和誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h的總RNA，同時(shí)提取對(duì)照酵母INVSc1(pYES2)抑制和誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h的總RNA。Northern blot結(jié)果顯示(圖3)：對(duì)照酵母INVSc1(pYES2)經(jīng)抑制和誘導(dǎo)培養(yǎng)后均檢測(cè)不到雜交信號(hào)，而重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)和INVSc1(pYES2-eIF5A4)在抑制培養(yǎng)中檢測(cè)不到信號(hào)，將碳源更換為半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，檢測(cè)到目的條帶，說(shuō)明重組酵母經(jīng)誘導(dǎo)后正常表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)基因酵母的非生物脅迫

為全面了解小黑楊eIF5A基因與脅迫的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)基因酵母經(jīng)2%半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)30 h后，經(jīng)過(guò)各種脅迫物質(zhì)處理后，按10倍逐級(jí)稀釋5級(jí)，然后將菌液點(diǎn)在SC-Ura培養(yǎng)基(2%葡萄糖為碳源)上，于30 ℃培養(yǎng)3 d后拍照觀察。如圖4所示：H2O處理的對(duì)照顯示轉(zhuǎn)eIF5A基因酵母與轉(zhuǎn)空載酵母生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，無(wú)明顯差異；經(jīng)0.2 mol/L ZnSO4、5% NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mol/L山梨醇和0.01% H2O2脅迫后，轉(zhuǎn)基因酵母與轉(zhuǎn)空載酵母在稀釋105倍后，菌落數(shù)量雖均明顯少于H2O對(duì)照處理，但轉(zhuǎn)基因酵母存活的菌落多于轉(zhuǎn)空載酵母；經(jīng)3 mmol/L CdCl2脅迫后，轉(zhuǎn)基因酵母生長(zhǎng)數(shù)量明顯高于轉(zhuǎn)空載酵母，菌落數(shù)約高出1個(gè)數(shù)量級(jí)；經(jīng)0.2 mol/L CuSO4脅迫后，酵母生長(zhǎng)狀態(tài)差異極其顯著，存活菌落數(shù)約高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。

M.DNA marker DL5000；泳帶1-8.8個(gè)pYES2-eIF5A2重組子的菌液PCR產(chǎn)物；泳帶10-17.8個(gè)pYES2-eIF5A4重組子的菌液PCR產(chǎn)物；泳帶9和18.陰性對(duì)照。

圖2 酵母表達(dá)載體pYES2-eIF5A2/4菌液PCR產(chǎn)物電泳

1.對(duì)照酵母INVSc1(pYES2)抑制36 h；2.對(duì)照酵母INVSc1(pYES2)誘導(dǎo)36 h；3.重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)抑制36 h；4-5.2個(gè)重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)株系誘導(dǎo)36 h；6.重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A4)抑制36 h；7-8.2個(gè)重組酵母INVSc1(pYES2-eIF5A4)株系誘導(dǎo)36 h。

圖3 轉(zhuǎn)基因酵母的Northern blot檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

eIF5A基因自發(fā)現(xiàn)起一直廣受研究者的關(guān)注，研究表明植物eIF5A基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著的重要作用[12-13]。在植物中，已有文獻(xiàn)表明eIF5A基因具有多種異構(gòu)體，諸如擬南芥有3種(AAG53646、AAG60110、AAM61392)、小麥有3種(DQ167202、DQ167201、DQ167203)、番茄有4種(AF296083、AF296084、AF296085、AF296086)。各種異構(gòu)體分別承擔(dān)不同的生物學(xué)功能，共同完成調(diào)控生物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及環(huán)境適應(yīng)等的生物學(xué)功能。Thompson等[14]在擬南芥中的研究表明：eIF5A1只在衰老組織中表達(dá)，eIF5A2在受機(jī)械損傷的組織中高水平表達(dá)，而eIF5A3在細(xì)胞分裂很活躍的吸脹的種子中高水平表達(dá)。煙草中的兩個(gè)的eIF5A基因NeIF5A1和NeIF5A2的表達(dá)存在差異。NeIF5A1更傾向于在光合作用的組織中表達(dá)，而NeIF5A2則是在所有檢測(cè)的植物組織中組成型表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)克隆出2條小黑楊eIF5A基因，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast分析表明，這2條基因分別和毛果楊eIF5A2和eIF5A4基因氨基酸序列完全一致，且這2條基因也只有3個(gè)氨基酸上的差異，推測(cè)這2條基因在楊樹中高度保守，且在功能上存在互補(bǔ)作用。

周建平等[7，16]對(duì)小麥eIF5A基因的研究表明，小麥eIF5A在根、成熟期的旗葉中低水平表達(dá)，而在幼葉、花粉、幼穗、幼胚等長(zhǎng)勢(shì)旺盛的部位(組織)中表達(dá)水平較高，這說(shuō)明小麥eIF5A基因具有組織表達(dá)的差異性。本研究通過(guò)對(duì)楊樹不同組織的eIF5A基因表達(dá)水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與上述小麥eIF5A基因的表達(dá)相似，只是在楊樹的幼苗中表達(dá)水平并不高，這可能和選取的材料是組培環(huán)境下的材料有關(guān)。先前已有研究報(bào)道水稻eIF5A基因受鹽脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)[17]，檉柳eIF5A基因在轉(zhuǎn)基因酵母中鹽及滲透脅迫具有抗性[18]。初步說(shuō)明，eIF5A基因與非生物脅迫有關(guān)，而本研究中楊樹eIF5A基因轉(zhuǎn)酵母對(duì)鹽和滲透脅迫并未表現(xiàn)出顯著差異，而是在Cu2+、Cd2+、Zn2+等重金屬離子脅迫下有更高的表達(dá)。這說(shuō)明eIF5A雖是高度保守性蛋白，但其功能仍存在物種間差異，說(shuō)明該基因在植物體內(nèi)可能參與多種非生物脅迫響應(yīng)途徑。

我國(guó)重金屬污染土壤的面積在逐漸擴(kuò)大，程度不斷加深，急需成熟、高效的植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。目前研究人員已經(jīng)開始利用植物基因工程技術(shù)分離克隆出多種相關(guān)基因，如金屬硫蛋白、植物螯合肽、液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等金屬結(jié)合蛋白基因，以提高植物的超積累能力或在植物體內(nèi)建立一條更廣泛的重金屬代謝途徑。本研究通過(guò)研究楊樹eIF5A基因的表達(dá)模式，并首次將其轉(zhuǎn)到真核模式生物釀酒酵母中分析其功能，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)能提高宿主酵母菌株對(duì)Cu2+等重金屬離子脅迫的抗性，這具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為后期在轉(zhuǎn)基因林木等植物方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

EV.轉(zhuǎn)空載體pYES2的酵母菌落；eIF5A2.轉(zhuǎn)重組載體pYES2-eIF5A2的酵母菌落；eIF5A4.轉(zhuǎn)重組載體pYES2-eIF5A4的酵母菌落。

[1] Caraglia M, Marra M, Giuberti G, et al. The role of eukaryotic initiation factor 5A in the control of cell proliferation and apoptosis[J]. Amino Acids,2001,20(2):91-104.

[2] Gordon E D, Mora R, Meredith S C, et al. Eukaryotic initiation factor 4D, the hypusine containing protein, is conserved among eukaryotes[J]. Biol Chem,1987,262(34):16585-16589.

[3] 雙寶,韓英鵬,李明,等.真核細(xì)胞翻譯起始因子5A(eIF5A)研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(8):156-160.

[4] Wang T W, Lu L, Zhang C G, et al. Pleiotropic effects of suppressing deoxyhypusine synthase expression inArabidopsisthaliana[J]. Plant Mol Biol,2003,52(6):1223-1235.

[5] Chou W C, Huang Y W, Tsay W S, et al. Expression of genes encoding the rice translation initiation factor, eIF5A, is involved in developmental and environmental responses[J]. Physiol Plant,2004,121(1):50-57.

[6] Dresselhaus T, Cordts S, L?rz H. A transcript encoding translation initiation factor eIF-5A is stored in unfertilized egg cells of maize[J]. Plant Mol Biol,1999,39(5):1063-1071.

[7] 周建平,楊足君,馮娟,等.小麥蛋白翻譯起始因子5A基因(eIF5A)的克隆與分析[J].遺傳,2006,28(5):571-577.

[8] Hopkins M T, Lampi Y, Wang T W, et al. Eukaryotic translation initiation factor 5A is involved in pathogen-induced cell death and development of disease symptoms in Arabidopsis[J]. Plant Physiol,2008,148(1):479-489.

[9] 張紅梅,夏新莉,尹偉倫.毛果楊的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(1):53.

[10] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[11] Schmitt M E, Brown T A, Trumpower B L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae[J]. Nucleic Acids Res,1990,18(10):3091-3092.

[12] Ma F, Liu Z, Wang T W, et al. Arabidopsis eIF5A3 influences growth and the response to osmotic and nutrient stress[J]. Plant Cell Environ,2010,33(10):1682-1696.

[13] Latha R, Salekdeh G H, Bennett J, et al. Molecular analysis of a stress-induced cDNA encoding the translation initiation factor, eIF1, from the salt-tolerant wild relative of rice[J]. Funct Plant Biol,2004,31(10):1035-1041.

[14] Thompson J E, Hopkins M T, Taylor C, et al. Regulation of senescence by eukaryotic translation initiation factor 5A: implications for plant growth and development[J]. Trends Plant Sci,2004,9(4):174-179.

[15] Chamot D, Kuhlemeier C. Differential expression of genes encoding the hypusine-containing translation initiation factor, eIF-5A, in tobacco[J]. Nucl Acids Res,1992,20(4):665-669.

[16] 周建平,楊足君,白麗莉,等.小麥蛋白翻譯起始因子5A(eIF5A)表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2007,13(3):301-303.

[17] Mehta A M, Saftner R A, Mehta R A, et al. Identification of posttranslationally modified 18-kilodalton protein from rice as eukaryotic translation initiation factor 5A[J]. Plant Physiol,1994,106(4):1413-1419.

[18] Wang L, Xu C, Wang C, et al. Characterization of a eukaryotic translation initiation factor 5A homolog fromTamarixandrossowiiinvolved in plant abiotic stress tolerance[J]. BMC Plant Biol,2012，12(1):118-134.

1) “十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2013AA102704-0103)資助。

曹鳳娟，女，1989年9月生，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。

曲冠證，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，副教授。E-mail:quguanzheng@hotmail.com。

2013年7月8日。

Q786; Q939.5

Enhancement of Tolerance to Abiotic Stress ofSaccharomycescerevisiaeTransformed by Genes Encoding Translation Initiation Factor,eIF5A2/4, fromPopulussimonii×Populusnigra/Cao Fengjuan, Zheng Tangchun, Zhao Siwen, Dai Lijuan, Qu Guanzheng(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(4).-16～20

責(zé)任編輯：潘 華。

Two genes encoding translation initiation factor,eIF5A2/4, were amplified by PCR from thePopulussimonii×Populusnigraleaf cDNA library. To confirm the tolerance ofeIF5A2/4 to abiotic stresses, a yeast expression vector pYES2-eIF5A2/4 was constructed and transformed intoSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1 with uracil auxotrophic phenotype. Northern blot method was used to detect theeIF5A2/4 mRNA transcription in yeast induced by galactose. The yeast expression strains ofeIF5A2/4 were constructed successfully. By comparing the colony numbers of transgenic INVSc1 (pYES2-eIF5A2/4) with non-transgenic INVSc1 (pYES2) grown in medium containing CdCl2, CuSO4, ZnSO4, NaCl, NaHCO3, sorbitol and H2O2stress, the survival colony numbers of transgenic INVSc1(pYES2-eIF5A2/4) are more than that of non-transgenic INVSc1 (pYES2), respectively. The results confirm thateIF5A2/4 can enhance the tolerance of yeast to abiotic stresses.eIF5A2/4 may play important roles in resistance of tree to abiotic stresses.