何相寶 侯志軍 何少文 王 納 李 杰 金 辛

(哈爾濱北方森林動(dòng)物園，哈爾濱，150300) (東北林業(yè)大學(xué)) (陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)) (東北林業(yè)大學(xué))

一種白頭鶴血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的建立及應(yīng)用1)

何相寶 侯志軍 何少文 王 納 李 杰 金 辛

(哈爾濱北方森林動(dòng)物園，哈爾濱，150300) (東北林業(yè)大學(xué)) (陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)) (東北林業(yè)大學(xué))

為了確定白頭鶴紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的生理值，以便給患病的白頭鶴提供必要的血液學(xué)診斷依據(jù)，采用了傳統(tǒng)的直接稀釋法對(duì)白頭鶴紅細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)，應(yīng)用新建立的白細(xì)胞分離法對(duì)白頭鶴的白細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)。經(jīng)測(cè)定，白頭鶴紅細(xì)胞的數(shù)量為0.415×1012/L，白細(xì)胞的數(shù)量為2.84×109/L，中性粒細(xì)胞為0.986×109/L，嗜堿粒細(xì)胞為0.345×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞為0.277×109/L，淋巴細(xì)胞為1.233×109/L。

白頭鶴；血細(xì)胞計(jì)數(shù)；白細(xì)胞分離法

白頭鶴是世界現(xiàn)存15種鶴類之一，是國(guó)家I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物,被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(ICUN)列為易危物種，并列入CETES附錄I中[1-3]。

家禽的血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]，但是家禽血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是否適用于白頭鶴還不清楚，白頭鶴血細(xì)胞計(jì)數(shù)的生理參考值也未建立。各種動(dòng)物的紅細(xì)胞手工計(jì)數(shù)方法均可采用稀釋法，哺乳動(dòng)物白細(xì)胞計(jì)數(shù)主要采用稀酸破壞法，家禽白細(xì)胞技術(shù)主要采用直接染色法[6]。對(duì)白頭鶴白細(xì)胞計(jì)數(shù)，本研究先采用了傳統(tǒng)的稀酸破壞紅細(xì)胞法、直接染色法，但計(jì)數(shù)效果均不理想。新建立的白細(xì)胞分離法則功的完成了對(duì)白頭鶴白細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；一次性真空采血管(肝素抗凝)；23 K超速低溫離心機(jī)(HERMLE)；LD5-2A型低速離心機(jī)；1640緩沖液；淋巴細(xì)胞分離液；肝素；胎盤藍(lán)。

1.2 樣本

2012年6月在哈爾濱北方森林動(dòng)物園用真空采血管采集了2只白頭鶴抗凝血樣本，放入冰箱內(nèi)4 ℃保存，備用。

1.3 方法

1.3.1 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

加生理鹽水995 μL于EP管中，用移液器吸取抗凝血5 μL，擦去管外余血，輕輕加至裝有生理鹽水的EP底部，再輕吸上清液清洗槍頭3次，上下顛倒混勻?；靹蚝笥靡埔簶寣⒓t細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，室溫下平放3 min，待細(xì)胞下沉后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的建立

由于對(duì)白頭鶴白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法還不是很成熟，所以先用雞血進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。具體試驗(yàn)方法如下：

取5 mL雞抗凝血放在10 mL離心管內(nèi)，向其中加入等量的1 640緩沖液混勻。取50 mL的離心管，將10 mL的人淋巴細(xì)胞分離液注入試管底部，然后將血液和1 640混合液緩慢的注入，使血液和1 640混合液漂浮在人淋巴細(xì)胞分離液的上面。將含有混合液的50 mL離心管放入離心機(jī)，3 000 r/min離心15 min。離心后，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血清分為3層，上層為血清，中間為白細(xì)胞，最底部為紅細(xì)胞。將血清和白細(xì)胞全部吸入到另外一個(gè)50 mL的離心管中，放入離心機(jī)中，3 000 r/min,離心10 min。離心后，棄掉所有液體，保留沉淀，向其中加入10 mL淋巴細(xì)胞分離液充分混合均勻。然后吸出100 μL白細(xì)胞渾濁液放入1.5 mL EP管中，加入900 μL的1 640緩沖液混合均勻。吸取200 μL的白細(xì)胞和1 640混合液放入到另外一個(gè)EP管內(nèi)，向其中加入等量的臺(tái)盼藍(lán)，染色2 min。將染色的白細(xì)胞懸液沖入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池，室溫下平放3分鐘，待細(xì)胞下后于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

用此方法，對(duì)同一樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 白細(xì)胞計(jì)數(shù)

用建立的白細(xì)胞分離計(jì)數(shù)法測(cè)定白頭鶴的白細(xì)胞數(shù)，具體方法同1.3.2。

1.3.4 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

涂片染色計(jì)數(shù)法[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一只雞進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其白細(xì)胞數(shù)分別為26×109、23×109、27×109個(gè)·L-1，經(jīng)計(jì)算，其平均值為(25.33±2.08)×109個(gè)·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.217%。本實(shí)驗(yàn)先用家雞進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立了一種禽類白細(xì)胞的測(cè)定方法。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，同一樣本3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.217%，說(shuō)明新建立的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性很好。預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的雞白細(xì)胞數(shù)量為25.33×109個(gè)·L-1，和以往文獻(xiàn)記載的雞的白細(xì)胞數(shù)量基本相當(dāng)[4-6]，進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)方法的有效性。

用淋巴細(xì)胞分離液將紅細(xì)胞和白細(xì)胞分離開(kāi)的方法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到禽類白細(xì)胞的相關(guān)研究中[7]，徐先云用此方法分離了野鳥(niǎo)的白細(xì)胞，并對(duì)白介素-2進(jìn)行了研究[8]。本實(shí)驗(yàn)借用此技術(shù)，分離了雞的白細(xì)胞，在對(duì)其染色后進(jìn)行了計(jì)數(shù)，新建了一種禽類白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。

2.2 白頭鶴細(xì)胞計(jì)數(shù)

按照1.3中描述的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)得2只白頭鶴的平均紅細(xì)胞數(shù)是(0.415±0.134)×1012個(gè)·L-1，白細(xì)胞數(shù)是(2.84±0.58)×109個(gè)·L-1，中性粒細(xì)胞0.986×109個(gè)·L-1，嗜堿粒細(xì)胞0.345×109個(gè)·L-1，嗜酸性粒細(xì)胞0.277×109個(gè)·L-1，淋巴細(xì)胞1.233×109個(gè)·L-1。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)出的白鶴紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量(0.415×1012、2.84×109個(gè)·L-1)，和其他鶴類相比數(shù)量偏低(見(jiàn)表1)，需要在以后的研究中進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)進(jìn)行分析其原因。

在用分離法分離白頭鶴白細(xì)胞的過(guò)程中，由于離心之后紅細(xì)胞層和白細(xì)胞層相臨，在操作的過(guò)程要避免白細(xì)胞收集的不完全或者帶有少量的紅細(xì)胞的現(xiàn)象出現(xiàn)，以免影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。將分離獲得的白細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，可使白細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)更加清晰，方便白細(xì)胞的計(jì)數(shù)，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

表1 鶴類血細(xì)胞計(jì)數(shù)參考值 個(gè)·L-1

在對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，由于禽類的紅細(xì)胞不容易破裂，所以禽類白細(xì)胞計(jì)數(shù)不用稀酸破壞紅細(xì)胞法，而采用直接染色法。但在本次實(shí)驗(yàn)中，一直不能將白頭鶴的白細(xì)胞染色，使得無(wú)法用直接染色法對(duì)白頭鶴進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。家雞白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以用直接染色法而白頭鶴不行的原因尚不清楚，需要進(jìn)一步分析。

3 結(jié)束語(yǔ)

本次試驗(yàn)獲得了白頭鶴的血常規(guī)生理指標(biāo)，為白頭鶴在患病時(shí)做血常規(guī)診斷提供了依據(jù)，但實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，需在以后進(jìn)一步收集實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行測(cè)定分析，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

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Count Method for Hooded Crane Blood Cells/

He Xiangbao

(Harbin North Forestry Zoo, Harbin 150300, P. R. China); Hou Zhijun(Northeast Forestry University); He Shaowen, Wang Na, Li Jie(Shannxi Foping National Nature Reserve); Jin Xin(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(6).-157～158

The experiment was conducted to get the data of hooded crane red blood cell count, white blood cell count, and white blood differential count in the health ones and provide the standard when hooded crane is in sick doing the blood diagnosis. The hooded crane red cells count was done by the dilution method, and the white cells count was done by new separation method. The red blood count of the hooded crane is 0.415×1012/L, the white blood count is 2.84×109/L, and the Neutrophil granulocyte, Basophil, Eosinophil, and Lymphocyte are 0.986×109/L, 0.345×109/L, 0.277×109/L, and 1.233×109/L.

Hooded crane; Blood cell count; White cell separation method

1) 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(DL13EA01)；黑龍江省博士后基金項(xiàng)目(LBH-Z12008)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2012M510908)國(guó)家林業(yè)局保護(hù)司項(xiàng)目。

何相寶，男，1975年6月生，哈爾濱北方森林動(dòng)物園，工程師。

金辛，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，博士研究生。E-mail：jinxin1103@163.com。

2013年8月20日。

S85.34+7.4

責(zé)任編輯：戴芳天。