王殿東 趙寶彥 潘麗梅

(長(zhǎng)江師范學(xué)院，重慶，408100) (北華大學(xué))

人參黑斑病菌毒素純化與結(jié)構(gòu)鑒定1)

王殿東 趙寶彥 潘麗梅

(長(zhǎng)江師范學(xué)院，重慶，408100) (北華大學(xué))

研究了人參黑斑病菌毒素的主要化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)及毒素量效關(guān)系。經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取的粗毒素再經(jīng)硅膠吸附色譜、制備液相色譜等進(jìn)行分離、純化，再經(jīng)生物測(cè)定，確定了成分相對(duì)較少的人參黑斑病菌毒素的有效成分的官能團(tuán)，并采用氣質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC-MS)的方法初步確定人參黑斑病菌毒素的主要成分為鄰苯二甲酸丁酯。

人參；黑斑病菌；毒素結(jié)構(gòu)

人參黑斑病是吉林省人參產(chǎn)區(qū)發(fā)病范圍最廣，危害最為嚴(yán)重的人參病害，嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)。黑斑病的病原菌為鏈格孢屬(Alternaria)真菌，該屬真菌可對(duì)多種五加科植物致病[1]，目前該病致病機(jī)制尚不完全清楚。病原真菌在與植物的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了寄生性和致病性，病原菌通過(guò)產(chǎn)生對(duì)植物有害的致病因子(酶、毒素、激素等)使寄主植物感病。其中致病毒素是植物病害中起重要作用的一類化合物，是某些植物病害的主要發(fā)病原因，對(duì)植物組織有明顯的損傷作用[2]。毒素的作用位點(diǎn)主要是在寄主植物細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體、葉綠體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，破壞細(xì)胞的膜體系，嚴(yán)重影響寄主的代謝，引起寄主蛋白、核酸等一系列的不良反應(yīng)，導(dǎo)致植株生理失調(diào)，細(xì)胞死亡乃至植株枯死。目前已分離到多種病原菌的致病毒素：Cuq等從玉米大斑菌的培養(yǎng)濾液中分離純化出一種稱為monocerin的物質(zhì)[3]；Bashan[4]從玉米大斑病菌的培養(yǎng)濾液中分離到結(jié)構(gòu)為Gln-Ser-Gly的三肽；Walton等[5]從燕麥維多利亞病菌中提取出一種Victorin毒素[5]；楊斌等[6]在松針褐斑病菌的代謝產(chǎn)物中分離到一種黃色固體物質(zhì)LA-Ⅱ；劉云惠等[7]在玉米大斑病菌毒素中分離到7種純組分其中組分2是5-羥甲基-2-呋喃甲醛標(biāo)準(zhǔn)毒素；崔洋等[8]在玉米小斑病病菌C小種的毒素培養(yǎng)濾液中分離出毒素toxin1；周毓君等[9]從草莓灰霉病病菌毒素中分離到2種毒素的主要活性成分；趙偉全等[10]在辣椒疫霉菌中分離到電泳純級(jí)別的毒素。這些毒素的分離純化推動(dòng)了人們對(duì)病原菌對(duì)植物致病物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為揭示植物病原真菌的致病機(jī)制奠定了重要的基礎(chǔ)，有助于認(rèn)識(shí)和防治植物病害。在前期的研究中，筆者通過(guò)人參黑斑病的粗毒素進(jìn)行接種試驗(yàn)表明其對(duì)健康的人參葉片具有致病作用，初步確定病菌毒素是人參黑斑病的重要致病因子[11]。在此基礎(chǔ)上本研究對(duì)毒素的化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)及毒素量效關(guān)系等進(jìn)行研究，旨在揭示毒素的致病機(jī)理，為研制鈍化人參黑斑病菌毒素的物質(zhì)奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

材料：人參黑斑病菌，由北華大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

粗毒素提?。簩⑷藚⒑诎卟【?，按實(shí)驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)好后，將菌液先用4層紗布過(guò)濾，再用2層濾紙抽濾得到全毒培養(yǎng)濾液共2 L，用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)其進(jìn)行濃縮。將濃縮后的培養(yǎng)濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法減壓回收乙酸乙酯近干，即獲得粗毒素提取物[12]。

硅膠柱分離：將提取的粗毒素拌硅膠，放置12 h自然干燥后計(jì)算干物質(zhì)質(zhì)量，上硅膠柱，用石油醚裝柱，以石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，收集不同部位。洗脫結(jié)束后，對(duì)上述各部分進(jìn)行減壓回收溶劑，分別用無(wú)菌水溶解，進(jìn)行生物測(cè)定，確定有生物活性的有效部分。

高效液相色譜(HPLC)分離：將硅膠柱層析得到的有效部位的合并物質(zhì)用甲醇溶解后，用0.45 μm膜過(guò)濾雜質(zhì)，液相色譜流動(dòng)相為70%甲醇溶液，在254、360、210 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行HPLC制備，收集組分[13-15]。對(duì)上述制備得到的各部分進(jìn)行減壓回收甲醇，分別用無(wú)菌水溶解后進(jìn)行生物測(cè)定，確定有效部位。

毒素結(jié)構(gòu)的鑒定：將經(jīng)過(guò)乙酸乙酯提取的毒素總提取物和HPLC制備的有效部位樣液分別置于100 mL三角瓶中蒸干(減壓蒸發(fā))，將其甲酯化后，分別采用GC-MS進(jìn)行分析，得到總提取物總離子流色譜圖和有效部位總離子流色譜圖，分析鑒定總提取物和有效成分的官能團(tuán)的化學(xué)成分，分析毒素組分及分子結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢索標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)NIST，用離子流色譜峰面積歸一化法確定各組分的相對(duì)含量。①色譜條件。DB-5 30 m×0.25 mm石英毛細(xì)管色譜柱；載氣為氦氣；界面溫度為280 ℃；進(jìn)樣口溫度為275 ℃；柱溫為60 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至275 ℃保持；流速為1.2 mL/min。②質(zhì)譜條件。電離方式為電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；掃描質(zhì)量范圍為33.00～450.00 amu；倍增器電壓1 000 V；溶劑切割時(shí)間3.0 min。

毒素的合成及生物驗(yàn)證：用GC-MS分析鑒定有效部位的組成，確定毒素成分，對(duì)毒素進(jìn)行合成，稱取1 g鄰苯二甲酸氫鉀(50 mL蒸餾水溶解)加入2 mL硫酸，用50 mL乙醚提取2次，水洗2次乙醚至水呈中性，揮發(fā)乙醚。加入10 mL正丁醇，緩慢加入1 mL硫酸，回流3 h，加入20 mL乙醚，20 mL 10% NaCl溶液(飽和)，萃取。乙醚用水洗至中性，無(wú)水硫酸鈉脫水，濃縮至干燥得到合成毒素鄰苯二甲酸丁酯，加入無(wú)菌水溶解進(jìn)行生物鑒定，觀察是否同樣產(chǎn)生病斑。

毒素含量與產(chǎn)生病斑的量效關(guān)系研究：配制成不同濃度(mL/L)的毒素溶液。采用針刺法將配制好的不同濃度的毒素溶液做生物測(cè)定，以產(chǎn)生病斑直徑最大的粗毒素為陽(yáng)性對(duì)照[11]，每個(gè)處理接種5片葉片，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，顯微鏡下測(cè)定病斑直徑大小，計(jì)算平均值，分析毒素量與產(chǎn)生病斑的量效關(guān)系，顯微鏡下測(cè)定病斑直徑大小，以DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠梯度洗脫結(jié)果

將乙酸乙酯提取的粗毒素干物質(zhì)4.15 g拌硅膠上樣，以石油醚洗脫500 mL后，改用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1洗脫500 mL，5∶2洗脫500 mL，5∶3洗脫500 mL，5∶4洗脫500 mL，5∶5洗脫液若干。在沒(méi)有出現(xiàn)譜帶之前每250 mL收集一次洗脫液，出現(xiàn)譜帶后將同一顏色譜帶收集在一起，同時(shí)收集2譜帶之間無(wú)顏色的中間帶，共收集到15個(gè)不同部位的洗脫液。對(duì)這15個(gè)部位進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果接種8號(hào)、9號(hào)的植物葉片出現(xiàn)明顯病斑，無(wú)菌水及其它各個(gè)回收物接種后無(wú)病斑出現(xiàn)，說(shuō)明8號(hào)、9號(hào)顯示生物活性，作為HPLC制備的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

2.2 HPLC分離

用高效液相色譜儀(Agilent1100)對(duì)硅膠柱分離得到的有效成分進(jìn)行分離制備。將硅膠柱層析得到的8號(hào)、9號(hào)有效部位的合并物質(zhì)進(jìn)行HPLC分離制備，共收集6部分組分，并得到制備色譜圖(圖1)。對(duì)制備得到的6個(gè)部分進(jìn)行生物測(cè)定。結(jié)果接種第三部分組份的植物葉脈、葉肉都有明顯壞死，確定第三部分有毒性活性，第三部分出現(xiàn)時(shí)間為8.0～10.0 min，為2號(hào)峰，收集到的流動(dòng)相體積為20 mL，是人參黑斑病致病毒素的有效部位。

2.3 毒素結(jié)構(gòu)鑒定

將乙酸乙酯提取的毒素總提取物與液相色譜分離有效部位分別進(jìn)行甲酯化，采用GC-MS(Agilent 6890N/5973i)進(jìn)行分析，得到總提取物總離子流色譜圖(圖2)和有效部位總離子流色譜圖(圖3)，得到總提取物色譜鑒定結(jié)果，有效部位鑒定結(jié)果(表1)。

根據(jù)表2的分析結(jié)果，有效部位甲酯化后含有乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙醇、醋酸丁酯、棕櫚酸甲酯、鄰苯二甲酸丁酯組分。乙酸乙酯為試劑峰，不是毒素成分，棕櫚酸甲酯是棕櫚酸的甲酯化產(chǎn)物，一般植物中都含有，不是毒素成分。丙酸乙酯、苯乙醇、醋酸丁酯為小分子化合物，接種后揮發(fā)較快，可能毒素作用較小，那么鄰苯二甲酸丁酯成為毒素的可能性最大，其分子式為C16H22O4，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖4。經(jīng)生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，合成毒素可產(chǎn)生與毒素培養(yǎng)液相似的病斑，說(shuō)明鄰苯二甲酸丁酯為人參黑斑病致病毒素。

2.4 毒素接種量與病斑直徑的量效關(guān)系

無(wú)菌水接種的葉片產(chǎn)生病斑平均直徑為0.30 mm，接種純毒素的葉片枯死，說(shuō)明該毒素對(duì)植物有強(qiáng)致病作用。接種人參黑斑病毒素培養(yǎng)濾液和不同濃度合成毒素溶液產(chǎn)生病斑平均直徑見(jiàn)表2。

表1 總提取物與有效部位甲酯化組分

圖2 培養(yǎng)液甲酯化GC-MS總離子流色譜圖

圖3 有效部位甲酯化GC-MS總離子流色譜圖

圖4 鄰苯二甲酸丁酯質(zhì)譜圖與結(jié)構(gòu)

表2 毒素接種量與病斑直徑平均值的關(guān)系

注：CK+為粗毒素；CK-為無(wú)菌水。表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

由表2可以看出，毒素接種量與病斑直徑無(wú)明顯線性關(guān)系。加入毒素量在0.01和0.02 mL/L時(shí)產(chǎn)生病斑直徑與接種無(wú)菌水產(chǎn)生病斑直徑無(wú)顯著差異，毒素量為0.03 mL/L病斑直徑有所上升，并且隨著毒素體積分?jǐn)?shù)的升高病斑直徑也呈遞增趨勢(shì)，在毒素量為0.06、0.07、0.20 mL/L時(shí)產(chǎn)生病斑與培養(yǎng)濾液產(chǎn)生病斑直徑無(wú)顯著差異，在毒素量為0.09 mL/L時(shí)病斑直徑達(dá)最大值，為0.96 mm，隨后隨著毒素量的增加，病斑直徑呈減小趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

本研究將乙酸乙酯萃取的粗毒素經(jīng)硅膠吸附色譜、制備液相色譜進(jìn)行分離，再經(jīng)生物測(cè)定確定了成分相對(duì)較少的人參黑斑病菌有效成分的官能團(tuán)采用氣質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC-MS)的方法鑒定毒素主要成分及分子結(jié)構(gòu)，初步確定為鄰苯二甲酸丁酯。Gu等[16]的研究表明，鄰苯二甲酸二丁酯最主要的危害在于環(huán)境激素作用，在極低的濃度下就可干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。Piersma等[17]發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)人和動(dòng)物具有致畸、致癌和致突變作用。李佳華等[18]、Dueck等[19]的研究均表明對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯高等植物具有毒性作用。這說(shuō)明本研究中分離到的鄰苯二甲酸丁酯具備成為人參黑斑病致病物質(zhì)的毒素條件。

采用合成的鄰苯二甲酸丁酯對(duì)健康的人參葉片進(jìn)行接種試驗(yàn)表明，鄰苯二甲酸丁酯能使健康的人參葉片產(chǎn)生病斑。當(dāng)毒素體積分?jǐn)?shù)在0.03 mL/L以上時(shí)可以使健康的人參葉片發(fā)生病變，在毒素量為0.09 mL/L病斑直徑達(dá)到最大值。這種毒素體積分?jǐn)?shù)低時(shí)不能致病而在一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)隨著毒素的增加病斑直徑增大，而當(dāng)毒素體積分?jǐn)?shù)達(dá)到某一特定值后病斑直徑開(kāi)始下降——即致病能力的變化趨勢(shì)與筆者之前采用粗毒素接種的趨勢(shì)完全吻合[11]。本研究中對(duì)人參黑斑病毒素量效關(guān)系的研究采用水作為載體，而沒(méi)有采用其他溶劑是因?yàn)榭紤]到毒素可能會(huì)與其它溶劑發(fā)生協(xié)同作用，影響試驗(yàn)結(jié)果。在量效關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)毒素在水中的溶解度影響了毒素的致病效果，所以在今后的試驗(yàn)中對(duì)人參黑斑病毒素的載體還有待進(jìn)一步研究。

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Purification and Structural Identification of Phytotoxin of Ginseng Black Spot Pathogen (Alternariapanax)/

Wang Diandong(Yangtze Normal College, Chongqing 408100, P. R. China); Zhao Baoyan, Pan Limei(Beihua University)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-122～125，130

Ginseng;Alternariapanax; Toxin

1) 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771733)。

王殿東，男，1979年8月生，長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，博士研究生。

潘麗梅，北華大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:good2094@yeah.net。

2013年4月24日。

S432.1

責(zé)任編輯：程 紅。

The experiment was conducted to isolate the impure toxin fromAlternariapanaxto clarify the chemical composition, molecular structure and dose-effect relationship of toxin of Ginseng black spot pathogenAlternariapanaxby silica gel adsorption chromatograph and preparative chromatography, respectively. Composition and molecular structure of the toxin was identified as butyl benzene o-dicarboxylate by Gas Chromatography-Mass Spectrometer.