白慶榮 謝昀燁 姜旭宇 孫慧穎 高 潔

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

高山紅景天立枯病菌菌絲融合群鑒定及藥劑敏感性1)

白慶榮 謝昀燁 姜旭宇 孫慧穎 高 潔

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

采用組織分離法從吉林省臨江市、安圖縣罹病高山紅景天植株分別獲得4、2個致病菌株。病菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)性狀、細胞核染色、菌絲融合及rDNA-ITS區(qū)序列測定結(jié)果表明：6個菌株均為茄立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)，屬多核絲核菌；臨江分離物J1～J4為AG-4-HGⅡ菌絲融合群，安圖分離物J5～J6為AG-1-IB菌絲融合群。19種殺菌劑對2個菌絲融合群的敏感性測定結(jié)果表明：2個菌絲融合群對蠟質(zhì)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、井岡·蠟芽菌的敏感性最好(EC50<0.005 mg/L)；對多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(強爾)的敏感性次之(EC50<1.0 mg/L)；對木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低(1.0 mg/L

景天立枯??；病原鑒定；菌絲融合群；藥劑敏感性

高山紅景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiala)的多年生草本植物，又名庫頁紅景天。主要分布在日本、俄羅斯、中國和朝鮮。在我國，主要分布在東北長白山區(qū)、大興安嶺及黑龍江省東部山區(qū)海拔1 700 m以上的高山凍原帶和岳樺林帶。高山紅景天素有“高原人參”和“雪山仙草”之稱，全株均可入藥，以根和根莖入藥為主[1]。其有效成分紅景天甙，具有抗衰老、抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤、抗病毒、增強腦機能、改善心肌等功能[2]。隨著吉林省北藥基地的建立，高山紅景天的人工栽培面積逐年加大。由于生境的改變，在栽培過程中受到很多病害的嚴重威脅，景天立枯病即為其中之一。2010年7月，在吉林省臨江市利生源藥業(yè)有限公司的高山紅景天基地病害發(fā)生嚴重時可造成紅景天苗床近70%幼苗死亡，嚴重威脅著景天的生產(chǎn)。2011年7月，吉林省安圖縣二道白河林場長白山科學(xué)研究院實驗基地的高山紅景天也遭到立枯病的嚴重危害，發(fā)病率近80%，損失嚴重。本研究對采自吉林省臨江市、安圖縣的病株進行了病原菌分離和鑒定，同時對病菌藥劑敏感性進行了研究，以期為病害綜合防治措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病害樣品分別采自吉林省臨江市利生源藥業(yè)有限公司的紅景天基地(2010年7月)和安圖縣二道白河林場長白山科學(xué)研究院實驗基地(2011年7月)。

1.2 方法

1.2.1 癥狀觀察

在吉林省臨江市利生源藥業(yè)有限公司的紅景天基地和安圖縣二道白河林場長白山科學(xué)研究院實驗基地中的高山紅景天苗圃地進行病害調(diào)查，拍照記錄病害發(fā)生的癥狀特點及危害情況。

1.2.2 菌株的分離與純化

采用組織分離法對采自臨江和安圖的景天立枯病植株的莖段進行病菌的分離。用刀片切取罹病植株莖段組織若干塊，在0.1%升汞中消毒0.5 min。用無菌水沖洗3次，置于水瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿2～4塊[3]，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。待長出菌絲后，取菌絲尖端進行轉(zhuǎn)板純化，得到純培養(yǎng)。

1.2.3 致病性測定

將每個純化的菌株接種在PDA平板上培養(yǎng)3 d后，取直徑8 mm的菌餅貼在當年生健康景天植株的莖基部(接種部位用無菌手術(shù)刀輕微劃傷)，用保鮮膜將接種部位包嚴，以接無菌PDA培養(yǎng)基為對照，每個菌株及對照分別接種20株。置溫室中20～25 ℃塑料袋保濕培養(yǎng)72 h。每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.2.4 病菌的培養(yǎng)學(xué)性狀觀察

將確定有致病性的菌株接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后，逐日觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，7 d后觀察培養(yǎng)基上的菌核形態(tài)。

1.2.5 細胞核染色

用解剖針在菌落邊緣挑一小塊菌絲，放在載玻片上，滴上清水，在顯微鏡400×的鏡頭下用接目測微尺測量菌絲直徑，每個菌株隨機測量50處。采用番紅O-KOH染色法對供試菌株進行細胞核染色，確定細胞核數(shù)目[4]。

1.2.6 病原菌菌絲融合群的測定

菌絲融合群測定所用的標準菌株為日本系統(tǒng)的AG-1～AG-5的代表菌株。采用常規(guī)玻片對峙培養(yǎng)法進行供試菌株菌絲融合鑒定。在超凈工作臺內(nèi)，將滅菌載玻片置于滅菌融化的2%的水瓊脂中浸后取出，平移入培養(yǎng)皿，水瓊脂成一薄層凝固在載玻片上。培養(yǎng)皿內(nèi)加2～4 mL滅菌水保濕。挑取標準菌絲融合群于載玻片正中，兩側(cè)間隔1.5～2.0 cm處置同一待測菌株，每菌株做3片，共6個重復(fù)。把載玻片放入培養(yǎng)皿中，在25 ℃下培養(yǎng)。待2菌落前緣在玻片中央相遇并交疊2～3 mm后(12～24 h)，取出玻片，鏡檢[5]。

1.2.7 病原菌rDNA-ITS區(qū)序列分析

以CTAB法[6]提取菌株基因組DNA為模板，ITS4/ITS5為引物進行PCR擴增。擴增的產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司純化并測序，并將測序所得的rDNA-ITS序列遞交GenBank并與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫中的ITS區(qū)相關(guān)序列進行同源性比較。

1.2.8 病原菌的藥劑敏感性測定

供試菌株：J1(AG-4-HGⅡ)，J5(AG-1-IB)。供試藥劑種類及生產(chǎn)單位見表1。

表1 供試藥劑種類及生產(chǎn)單位

采用菌絲生長速率法，測定供試菌株對不同種類不同質(zhì)量濃度藥劑的敏感性。每種藥劑配制成質(zhì)量濃度分別為1×103、1×102、1×10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含藥平板。將在PDA平板中活化擴繁的菌種用打孔器打取直徑為8 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板中央，每個質(zhì)量濃度3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測量供試病菌在含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)，與對照比較計算各藥劑處理對病菌的生長抑制率。查機率值與死亡率(抑制率)換算表，用最小二乘法建立毒力回歸方程，計算出各藥劑對病原菌的有效中濃度(EC50)，比較病原菌對各種藥劑的敏感程度。抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅原始直徑)×100%[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察

景天立枯病主要危害景天莖基部，發(fā)病初期莖基部有褐色病斑，隨著植株的生長病斑逐漸擴展，病斑繞莖一周后，病部明顯縊縮，病斑上部植株生長明顯衰弱，若濕度大時，病斑繼續(xù)縱向發(fā)展，延伸到葉片，受害葉片呈成水燙狀，濕腐，病莖呈褐色至深褐色壞死。有時病部出現(xiàn)隱約的輪紋，病斑上密生灰白色菌絲，逐漸集聚成團，最后形成褐色菌核，受害植株根部腐爛，極易拔出，最終植株大量死亡(圖1)。

圖1 景天立枯病癥狀

2.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法在臨江市利生源藥業(yè)有限公司的紅景天基地采集的病害標本獲得了4個培養(yǎng)性狀基本一致的純化菌株；在安圖縣二道白河林場長白山科學(xué)研究院實驗基地采集的病害標本獲得了2個培養(yǎng)性狀基本一致的純化菌株，在PDA斜面培養(yǎng)基上保存，使用時轉(zhuǎn)至PDA平板培養(yǎng)基上活化。

2.3 純化菌株的致病性測定

6個純化菌株致病性測定結(jié)果顯示：接種的植株保濕3 d后開始表現(xiàn)癥狀，發(fā)病率達100%，接種發(fā)病癥狀與田間病害癥狀一致，對照植株未見異常。從接種發(fā)病植株上分離到的病原菌，其形態(tài)與田間發(fā)病植株上分離到的相同，證明分離純化得到的菌株均為該病害的病原菌。

2.4 病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)鑒定

臨江代表菌株J1、J2、J3、J4菌絲體無色，菌落平鋪，后逐漸變褐色，呈同心輪紋狀。培養(yǎng)4 d后菌絲體開始糾結(jié)成白色菌絲團，成熟后變成褐色菌核(圖2A)。菌絲近直角分枝，分枝處明顯縊縮，不遠處有一隔膜，菌絲直徑較寬，大小為7.46～12.16 μm，細胞核數(shù)目4～13個(圖2C-D)。安圖代表菌株J5、J6菌絲體無色，呈放射狀平鋪培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)4 d后形成褐色菌核(圖2B)。菌絲近直角分枝，分枝處明顯縊縮，不遠處有一隔膜，菌絲直徑大小為3.55～10.91 μm，細胞核數(shù)目5～15個(圖2C-D)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特點鑒定臨江和安圖兩地的菌種均可能為茄立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)，屬多核絲核菌。

圖2 景天立枯病菌培養(yǎng)學(xué)性狀、菌絲形態(tài)及細胞核染色

2.5 菌絲融合群的測定

采用常規(guī)玻片法進行供試菌株菌絲融合鑒定。供試菌株J1與AG-4-HG Ⅱ標準菌株發(fā)生融合(圖3A)，表明供試菌株為立枯絲核菌AG-4-HG Ⅱ亞群的成員；J5與AG-1-IB標準菌株發(fā)生融合(圖3B)，表明供試菌株為立枯絲核菌AG-1-IB亞群的成員。

圖3 菌絲融合

2.6 rDNA-ITS區(qū)序列分析

以ITS4和ITS5為引物，對菌株J1的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。J1、J2、J3、J4擴增結(jié)果均為715 bp的DNA片段(GenBank accession FR878087)，與GenBank中的AG-4-HGⅡ亞群(GenBank accession JX843820，HQ629873)的序列相似性為100%。菌株J5、J6的rDNA-ITS區(qū)PCR結(jié)果均為631 bp的DNA片段與GenBank中的AG-1-IB亞群YMK060(Gen-Bank accession FJ440191)的序列相似性為100%，進一步驗證了形態(tài)學(xué)鑒定的正確性。

2.7 菌絲融合群對殺菌劑的敏感性

引起景天立枯病的立枯絲核菌AG-4-HGⅡ和AG-1-IB菌絲融合群對7種生物殺菌劑和12種化學(xué)農(nóng)藥的敏感性存在差異(表2)。2個菌絲融合群對蠟質(zhì)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(穩(wěn)稻)、井岡·蠟芽菌的敏感性最好，其EC50<0.005 mg/L；對多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(強爾)的敏感性次之，EC50<1.0 mg/L；對木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低，1.0 mg/L

表2 菌絲融合群對19種藥劑的敏感性

3 結(jié)論與討論

從吉林省臨江市利生源藥業(yè)有限公司紅景天基地罹病高山紅景天植株分離到4個有致病性的菌株。從安圖縣二道白河林場長白山科學(xué)研究院實驗基地罹病高山紅景天植株中獲得2個有致病性的菌株。病菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)性狀、細胞核染色、菌絲融合及rDNA-ITS區(qū)序列測定結(jié)果表明：分離到的病菌為茄立枯絲核菌，屬多核絲核菌，J1～J4為AG-4-HGⅡ菌絲融合群；J5～J6為AG-1-IB菌絲融合群。李熙英、黃世臣等[8-9]報道了吉林省和龍市紅景天基地苗圃發(fā)生的立枯病病原為茄立枯絲核菌，并對病菌的生物學(xué)特性進行了研究，尚未對病菌的菌絲融合群進行鑒定。2012年筆者首次報道了吉林省臨江市高山紅景天立枯病由AG-4-HGⅡ菌絲融合群引起[10]。本研究將從吉林省臨江市、安圖縣采集到的2個引起高山紅景天立枯病的菌絲融合群進行比較研究，在其它地區(qū)是否存在更多的菌絲融合群可引起高山紅景天立枯病還有待于探究。

2個菌絲融合群對生物制劑蠟質(zhì)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(穩(wěn)稻)、井岡·蠟芽菌的敏感性最好；對多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(強爾)的敏感性次之；對木霉菌和寡雄腐霉的敏感性略低。2個菌絲融合群對化學(xué)殺菌劑肟菌·戊唑醇、氟硅唑、腐霉利、多菌靈敏感性較高；對異菌脲和菌核凈的敏感性次之；對氟菌唑、百菌清和咪鮮胺的敏感性略低。不同菌絲融合群對相同殺菌劑的敏感性基本一致，對個別殺菌劑的敏感性存在差別。2個菌絲融合群對咯菌腈、噁霉靈、嘧霉胺的敏感性存在差異，AG-1-IB菌絲融合群對這3種殺菌劑較為敏感，而AG-4-HGⅡ菌絲融合群對這3種殺菌劑的敏感性較差。這與蒙姣榮等[11]對廣西玉米紋枯病的菌絲融合群的敏感性的研究結(jié)果有相似之處。

總體上看，2個菌絲融合群對生物殺菌劑的敏感性更高。筆者認為與試驗中選用了營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基利于促進生防菌的自身生長，進而增加其抑菌效果有關(guān)。生物殺菌劑能否在病害防治過程中表現(xiàn)出良好的防治效果，還需進一步的田間藥效試驗。綜合評價室內(nèi)試驗中對病菌具有良好抑制作用的生防藥劑，為指導(dǎo)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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[3] 周而勛,楊媚.從植物病組織中分離立枯絲核菌的快速、簡便技術(shù)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,19(1):125-126.

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Anastomosis Group Identification and Susceptibility to Fungicides onRhodiolasachalinensisDamping off in Jilin Province/

Bai Qingrong, Xie Yunye, Jiang Xuyu, Sun Huiying, Gao Jie(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-107～111

Rhizoctoniasolanidamping off; Pathogen identification; Anastomosis group; Susceptibility

白慶榮，女，1975年11月生，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，副教授。

高潔，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教授。E-mail：jiegao115@126.com。

2013年4月15日。

S435.672

1) 吉林省自然科學(xué)基金(20101565)。

責(zé)任編輯：程 紅。

Six isolates with pathogenicity were obtained from the stems of diseased plants with tissue isolation method (four isolates from Linjiang City and two isolates from Antu County). The experiment was conducted to investigate their characteristics of morphology and cultivation.RhizoctoniasolaniKühn is the pathogen of the disease. Anastomosis groups are determined to be AG-1-IB subgroup in Antu and AG-4-HGⅡsubgroup in Linjiang by pairing isolates with tester trains and sequence analysis of rDNA-ITS region. By fungicides susceptibility test, two anastomosis groups are most sensitive toBacilluscereus,B.subtilis(1011/g), Validamycin·B.cereus(EC50<0.005 mg/L) followed byPaenibacilluspolymyxa,B.subtilis(108/g)(EC50<1.0 mg/L),TrichodermaandPythiumoligandrum(1.0 mg/L