李 驍 徐晶光 侯 雪 趙 科 解紅霞

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010029;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

鐵線蓮屬(Clematis)隸屬于毛茛科，全世界約有300種，廣泛分布于除南極洲以外的各大洲。我國約有108種，各地均有分布［1］。內(nèi)蒙古地區(qū)有16種6變種［2］，經(jīng)本草考證［2-5］，其中入蒙藥的植物有:芹葉鐵線蓮(Clematis aethusifolia)、黃花鐵線蓮(C.intricata)、長瓣鐵線蓮(C.macropetala)、短尾鐵線蓮(C.brevicaudata)、棉團鐵線蓮(C.hexapetala)和辣蓼鐵線蓮(C.mandshurica)(又名:東北鐵線蓮［6，7］)。鐵線蓮屬植物具有鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎和抗癌等多種藥理活性，其藥理作用與化學成分密切相關，化學成分主要為皂苷類、黃酮類、生物堿;此外還包括揮發(fā)油、特有成分及花色苷、香豆素、有機酸類、烷烴等其他化合物［8］。鐵線蓮屬蒙藥材主要含有三萜類、黃酮類和生物堿類化合物［9］。

黃酮類化合物具有抗氧化［10］、清除自由基［11］、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)［12～13］、抗癌防癌［14～15］、抗衰老［16］、抗炎抑菌［17］等功效，還具有吸收紫外輻射、抗過敏及保肝［18］等作用。三萜類化合物具有消炎［19］、抗菌［20］、抗腫瘤［21］、保肝［22］、免疫調(diào)節(jié)［23］、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)［24］、抗衰老［25］、神經(jīng)保護［26］等作用。

有關鐵線蓮屬蒙藥材化學成分的鑒別研究，多為對某種鐵線蓮的單一化學成分進行鑒別研究［27］，然而對鐵線蓮屬入蒙藥的6種鐵線蓮主要化學成分(黃酮類和三萜類)進行整體化、系統(tǒng)化鑒別研究還未見報道。本研究主要通過薄層色譜法對鐵線蓮屬蒙藥材中的黃酮類和三萜類化合物進行鑒別，從而為鐵線蓮屬蒙藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為其黃酮類和三萜類化合物的深度開發(fā)利用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 藥材:棉團鐵線蓮(Clematis hexapetala)，芹葉鐵線蓮(C.aethusifolia)，黃花鐵線蓮(C.intricata)，短尾鐵線蓮(C.brevicaudata)，辣蓼鐵線蓮(C.mandshurica)，長瓣鐵線蓮(C.macropetala)的植株干燥全草。蒙藥材原植物均經(jīng)筆者鑒定，憑證標本保存于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院藥用植物標本室。

1.2 對照品:齊墩果酸(中國藥品生物制品檢定所，110709-200505)、熊果酸(中國藥品生物制品檢定所，1107042-200516)、長春藤皂苷元(中國藥品生物制品檢定所，111733-200502)、蘆丁(自制)、槲皮素(自制)、山奈酚(中國藥品生物制品檢定所，110861-200808)

1.3 儀器:HC-TP11-5架盤藥物天平(上海精科天平)、ZF-20D暗箱式紫外分析儀(南京科爾儀器設備有限公司)、玻璃板(20cm ×20cm、10cm ×20cm)。

1.4 試劑:濃硫酸、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、1%氯化鋁溶液、香草醛、冰乙酸、甲酸、硅膠GF254(青島海洋化工有限公司制造)、羧甲基纖維素鈉(天津市光復精細化工研究所)。

2 藥材來源

于2009～2011年藥材采收期采集6種鐵線蓮植物全草，置于陰涼通風干燥處儲存。藥材來源詳見表1。

表1 藥材來源及采集時間

3 理化鑒別

3.1 藥材粗提物的制備:取6種鐵線蓮干燥全草粉碎，稱取粉末10g，加95%乙醇60～70mL，過夜。水浴回流加熱提取1h(溶液保持微沸)，過濾。濾渣加入95%的乙醇40～60mL，水浴加熱提取30～40mins，過濾;濾渣再加入95%乙醇50～60mL，水浴加熱提取30～40mins，過濾。合并濾液，濃縮備用。

3.2 黃酮類的檢識［28］:鹽酸-鎂粉反應:取適量濃縮液于試管中，加入1mL甲醇，搖勻，加入少量鎂粉振搖，再加入幾滴濃鹽酸，1min后觀察現(xiàn)象，若反應試液顯紫紅色，說明反應結(jié)果呈現(xiàn)陽性。

三氯化鋁反應:取適量濃縮液于試管中，用吸管吸取試液滴加于濾紙上成兩排，再于下排滴加三氯化鋁溶液，上排作為空白對照。將濾紙置于紫外燈下觀察，若滴加有三氯化鋁溶液的一排在紫外燈下呈現(xiàn)淡黃色熒光，說明反應結(jié)果呈陽性。

三氯化鐵反應:取適量濃縮液于試管中，加入三氯化鐵的乙醇溶液，觀察反應現(xiàn)象，若試液呈現(xiàn)紫色，說明反應結(jié)果為陽性。

上述實驗陽性結(jié)果表明藥材粗提液中含有黃酮類化合物。

3.3 皂苷類的檢識［28］:Libermanm-Burchard反應:取濃縮液適量于試管中，加入乙酸酐并混勻，加入幾滴濃硫酸-乙酸酐(1:20)，觀察反應現(xiàn)象，試液顯示顏色變化。若藥材提取物中含有三萜皂苷，試液顏色一般由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色、紫色、藍色、污綠色。

Salkowaki反應:將濃縮液溶于適量CCl4中，然后沿試管壁慢慢加入到濃H2SO4中，如兩液面交界處出現(xiàn)深紅色或棕紅色，說明樣品中含有三萜皂苷。

泡沫試驗:取適量濃縮液于試管中，強烈振搖后靜置10mins，觀察現(xiàn)象，經(jīng)強烈振搖后若產(chǎn)生持久性白色泡沫，則表明藥材提取物中含有皂苷類化合物。

3.4 檢識結(jié)果:如表2所示，6種鐵線蓮在鹽酸-鎂粉、三氯化鐵、三氯化鋁反應中均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明6種鐵線蓮中均含有黃酮類化合物。6種鐵線蓮在Libermanm-Burchard反應、Salkowaki反應、泡沫試驗中均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明6種鐵線蓮中均含有三萜皂苷類化合物。

表2 6種鐵線蓮藥材粗提液理化鑒別情況一覽表

4 薄層鑒別

4.1 供試品的制備:按表1第一批、第二批提取。將鐵線蓮屬6種藥材的全草剪碎，分別稱取約5g，分別加70%乙醇70mL，浸泡過夜。水浴回流加熱提取1h(溶液保持微沸)，過濾;濾渣中加入70%的乙醇60mL，水浴加熱提取30min，過濾;將2次濾液合并，水浴蒸干，加少量無水乙醇溶解，10mL容量瓶中定容，作為供試品溶液。將6種藥材按前述方法，分別用95%乙醇再提取。

4.2 對照品的制備:取槲皮素、山奈酚、齊墩果酸、熊果酸對照品適量加無水甲醇溶解，作為對照品溶液。

4.3 薄層層析

4.3.1 黃酮類的薄層層析:用毛細管吸取對照品溶液各2μL，供試品溶液各5μL點于同一塊硅膠板，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(9:3:1)為展開劑［29］，展距 10cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁醇溶液，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視，在供試品譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光，結(jié)果詳見圖1。

結(jié)果顯示:如薄層圖譜所示，山奈酚標準品對應位置上，只有第二批70%的棉團鐵線蓮含有，其他供試品在365nm的紫外熒光下在相同位置下均未見相同熒光;而在自制槲皮素標準品相應位置上，第一批和第二批供試品中，70%和90%的供試品在365nm紫外熒光下，均有熒光，只是各自的含量有所差異，因而所顯熒光深淺也不同。

圖1 鐵線蓮屬蒙藥材黃酮類化合物的薄層層析鑒別圖譜

4.3.2 三萜皂苷類的薄層層析:用毛細管吸取對照品溶液各2μL，供試品溶液各5μL點于同一塊硅膠板，以甲苯:乙酸乙酯:冰乙酸(14:4:0.5)為展開劑［27］，展距 10cm，取出，晾干，噴以香草醛濃硫酸溶液，在105℃的條件下烘干，在供試品譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同的顏色，結(jié)果詳見圖2。

結(jié)果顯示:如上圖譜所示，在標準品顯色的位置上，第一批和第二批的70%和95%的供試品均在與供試品同一位置上顯色，且齊墩果酸顯紫色，與供試品所顯顏色相同，而熊果酸在同一位置上也顯色，但是顏色接近橘紅色。

圖2 鐵線蓮屬蒙藥材三萜類化合物的薄層層析鑒別圖譜Fig2.TLC of Triterpenoid Saponins of six species in Clematis

5 結(jié)論

通過對鐵線蓮屬蒙藥材的化學成分的理化檢識，6種鐵線蓮中含有黃酮類和三萜類化合物;棉團鐵線蓮中含有山奈酚;芹葉鐵線蓮、黃花鐵線蓮、短尾鐵線蓮、棉團鐵線蓮、長瓣鐵線蓮及辣蓼鐵線蓮中均含有槲皮素。6種鐵線蓮蒙藥材中均含有齊墩果酸。

6 討論

試驗中針對含量測定配制供試品溶液的不同提取方法，不同提取溶劑(70%乙醇、95%乙醇和水)，分別考察。結(jié)果以70%及95%乙醇回流提取1.5h效果最好，雜質(zhì)較少。

鐵線蓮的薄層色譜鑒別，根據(jù)文獻香椿［29］的TLC展開條件對樣品進行鑒別，經(jīng)反復試驗，采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9:3:1)溶液為展開劑進行展開，對于黃酮類成分分離效果較好，薄層鑒別熒光斑點清晰、明確;根據(jù)文獻［27］對齊墩果酸的測定，最終采用甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(14:4:0.5)溶液為展開劑，分離效果較好，斑點清晰。

內(nèi)蒙古鐵線蓮屬植物資源豐富，有16種6變種［2］，除本實驗研究的入蒙藥的6種鐵線蓮以外，還可入藥的有大葉鐵線蓮、西伯利亞鐵線蓮和甘青鐵線蓮［9］。通過本研究對鐵線蓮屬蒙藥材中黃酮類和三萜類化合物的薄層鑒別，為鐵線蓮屬蒙藥材不同采收期主要化學成分(黃酮類和三萜類化合物)的變化研究和資源化學研究奠定了前期工作基礎，從而為該屬蒙藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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