（華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州 510640）

枇杷是水果中的佳品，不僅果肉柔軟多汁，酸甜適口，營養(yǎng)豐富，而且“具秋萌、冬花、春實(shí)、夏熟，備四時(shí)之氣”，頗受醫(yī)學(xué)家的青睞。枇杷果實(shí)除鮮食之外，主要是對(duì)果肉進(jìn)行加工，如加工成果脯及釀成果醋和果酒。而枇杷核往往被丟棄，造成了資源的浪費(fèi)。故研究枇杷核中的功效成分為對(duì)枇杷的利用提供了一定的理論參考。

多酚類物質(zhì)是廣泛存在于植物內(nèi)的多元酚類化合物，具有獨(dú)特的生理活性和藥理活性[1-2]。按其結(jié)構(gòu)大致可分為類黃酮、木聚素、酚酸和木酚素[3]。由于其結(jié)構(gòu)各異，生物利用率、抗氧化性及對(duì)人體的影響也有差異。但多酚化合物的共同特點(diǎn)還是保持不變的，其良好的抗氧化活性，能預(yù)防和治療多種疾病[4]，多酚與VC、VE和胡蘿卜素等其它抗氧化物在體內(nèi)一起發(fā)揮抗氧化功效，清除有害人體健康的自由基[5]。故植物多酚這一來源于綠色植物的可再生生物質(zhì)材料現(xiàn)正逐漸成為研究的熱點(diǎn)，并在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。枇杷果實(shí)、花、葉中都含有一定量的多酚[6-7]，也有不少研究者對(duì)此進(jìn)行了研究。而枇杷核中存在的多酚，鮮有人進(jìn)行詳細(xì)的分析與測定。本文針對(duì)枇杷核中的多酚進(jìn)行研究，為開發(fā)利用枇杷核中的多酚提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品與試劑

枇杷核：購于福建莆田；無水乙醇（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚：上海源聚生物科技有限公司；沒食子酸（AR）：浙江省溫州市甌油精細(xì)化工公司；無水碳酸鈉：廣州化學(xué)試劑廠；超純水：Milli-Q超純水系統(tǒng)。

200 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取20.0 mg沒食子酸，用超純水溶解后定容到100 mL。

1.1.2 儀器

BS124S精密電子天平：德國賽多利斯天平公司；HR2004多功能榨汁機(jī)：飛利浦電子香港有限公司；KQ2200B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；U3010紫外可見分光光度計(jì)：日本HITACHI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枇杷核樣品的預(yù)處理

將枇杷核曬干后去掉外皮，放置于榨汁機(jī)中攪碎成粉末狀。

1.2.2 枇杷核中多酚的提取

稱取粉碎后的樣品1g（精確到0.1mg）置于100mL的磨口三角瓶中，按不同的料液比加入一定濃度的乙醇-水溶液，置于超聲儀器中，在一定溫度下提取一段時(shí)間，將提取液冷卻后抽濾，用相應(yīng)溶劑定容到50 mL。

1.2.3 多酚的測定

準(zhǔn)確移取一定體積的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或枇杷核多酚提取液于具塞比色管中，然后依次加入3.5 mL 20%的福林酚試劑和1.5 mL10%的碳酸鈉溶液，用水定容到10 mL，顯色70 min后，在670 nm處測定其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色條件的選擇

2.1.1 碳酸鈉加入量的選擇

取已編號(hào)的10支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，20%的福林酚溶3.0 mL，然后按照1～9的順序分別加入10%的碳酸鈉溶液0.5、0.8、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.5、4.0 mL，用超純水定容到 10 mL，10 號(hào)為空白樣。放置2 h后測定吸光度。結(jié)果如表1。

表1 碳酸鈉加入量對(duì)顯色的影響Table 1 The effect of Na2CO3on the colored reaction

隨著碳酸鈉加入量的增加，吸光度逐漸增大，增加到1.8 mL時(shí)，達(dá)到最大，然后再增加碳酸鈉的量，吸光度不斷降低，故選擇碳酸鈉的加入量為1.8 mL。

2.1.2 福林酚加入量的選擇

取已編號(hào)的8支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，10%的碳酸鈉溶液1.8 mL，然后按照1～7的順序分別加入20%的福林酚溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用超純水定容到 10 mL，8 號(hào)為空白樣。放置2 h后測定吸光度。結(jié)果如表2。

表2 福林酚加入量對(duì)顯色的影響Table 2 The effect of phenol regent on the colored reaction

隨著福林酚用量的增加，吸光度逐漸增大，當(dāng)達(dá)到2.5 mL的時(shí)候達(dá)到最大，然后繼續(xù)增大福林的用量，吸光度有小幅度的降低，故選擇福林酚的加入量為2.5 mL。

2.1.3 顯色時(shí)間的選擇

取已編號(hào)的11支具塞比色管，依次加入樣品提取溶液1.0 mL，10%的碳酸鈉溶液1.8 mL，20%的福林酚溶液2.5 mL，用超純水定容到10 mL，11號(hào)為空白樣。放置5 min之后測定吸光度。結(jié)果如表3。

表3 時(shí)間對(duì)顯色的影響Table 3 The effect of time on the colored reaction

隨著時(shí)間的不斷增加，吸光度緩慢增加，當(dāng)時(shí)間為70 min的時(shí)候吸光度開始趨于穩(wěn)定。最終選擇顯色時(shí)間為70 min。

2.1.4 顯色條件的正交試驗(yàn)

多酚的顯色主要是由碳酸鈉（A）用量，福林酚（B）用量，顯色時(shí)間（C）來決定。故本文采用三因素三水平L9（33）的正交實(shí)驗(yàn)選擇最佳的顯色條件，見表4。

表4 顯色反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 4 The factors and levels of the colored reaction

表5 顯色反應(yīng)的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The orthogonal experimental results of the colored reaction

由上述極差分析得到，影響該顯色反應(yīng)各因素的主次順序?yàn)?0%的碳酸鈉＞20%的福林酚＞顯色時(shí)間。根據(jù)上數(shù)據(jù)得到顯色的最佳條件為：10%的碳酸鈉1.5 mL，20%的福林酚3.5 mL，顯色時(shí)間為70 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線的繪制

取 200 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05、0.10、0.25、0.50、0.75 mL于10 mL的具塞比色管中，依次加入3.5 mL的20%的福林酚溶液，1.5 mL10%的碳酸鈉溶液，用超純水定容到10 mL，顯色后測定其吸光度A。以吸光度A為縱坐標(biāo)，沒食子酸的濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖1?；貧w方程為：Y=0.034 27+0.099 53X（R2=0.998）。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Gallic acid standard curve

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 乙醇濃度的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品7份，分別加入乙醇濃度為20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液35 mL，在室溫下超聲90 min，抽濾，將濾液用相應(yīng)的溶劑定容到50 mL，取1.00 mL按照最佳顯色條件顯色后測其吸光度，得到圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%的時(shí)候，多酚的提取量達(dá)到最大。乙醇濃度過小或者太大都會(huì)減少多酚的浸出，當(dāng)乙醇濃度小于60%時(shí)，溶劑還不足以將枇杷核中的多酚完全提取出來，當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，由于乙醇濃度過高，導(dǎo)致多酚隨著多糖一起沉淀下來，而使多酚檢出量降低。

2.3.2 提取時(shí)間的選擇

稱取1g（精確到0.1mg）樣品7份，加入35mL60%的乙醇溶液，在室溫下分別超聲 10、30、60、90、120、150、180min后抽濾，濾液用60%的乙醇定容到50 mL。移取1.00 mL樣品溶液，按最佳條件顯色后測定其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)提取的影響Fig.3 The effect of time on extraction

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取出的多酚隨之增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，提取的量基本保持不變，故提取時(shí)間120 min已經(jīng)足夠。

2.3.3 料液比的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品6份，分別加入60%的乙醇溶液 10、20、25、30、35、40mL，室溫下超聲 120min，抽濾，濾液用60%的乙醇溶液定容到50mL。取1.00 mL的樣品溶液按照最佳顯色條件進(jìn)行顯色，測對(duì)應(yīng)的吸光度，得到圖4。

圖4 料液比對(duì)提取的影響Fig.4 The effect of material-liquid rate on extraction

由圖知當(dāng)料液比在 1 ∶10～1 ∶25（g/mL）時(shí)，多酚的提取率隨著料液比的增加而增大，但是當(dāng)料液比大于1∶25（g/mL）時(shí)，多酚的提取率隨著料液比的增加反而降低，這可能是當(dāng)料液比增加時(shí)，水含量也相應(yīng)增加，與樣品接觸的機(jī)會(huì)增多，阻礙了多酚與乙醇的接觸，導(dǎo)致多酚浸出量減少。故最終得到最佳的料液比為1∶25（g/mL）。

2.3.4 提取溫度的選擇

稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品8份，加入60%的乙醇溶液 25 mL，分別置于 20、30、40、50、60、70、80、90℃下超聲120 min，抽濾，濾液用60%的乙醇溶液定容到50 mL。取1.00 mL的樣品溶液按照最佳顯色條件進(jìn)行顯色，測對(duì)應(yīng)的吸光度，得到圖5。

圖5 溫度對(duì)提取的影響Fig.5 The effect of temperature on extraction

由數(shù)據(jù)知，溫度越高，反應(yīng)越劇烈，提取率越大。但是當(dāng)達(dá)到90℃時(shí)，提取率降低，可能是溫度過高，導(dǎo)致多酚部分分解。故選擇溫度為80℃。

2.3.5 提取條件的正交試驗(yàn)

多酚的提取主要受提取溫度，乙醇濃度，料液比，提取時(shí)間的影響。本文采用四因素三水平L9（43）的正交試驗(yàn)選擇最佳的提取條件，正交試驗(yàn)的因子水平見表6，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7。

表6 提取條件的實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 6 The factors and levels of the extraction

表7 超聲提取法的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 The orthogonal experimental results of the ultrasonic wave-assisted extraction

由以上極差分析可知，影響多酚提取的各因素中，其主次順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比。樣品的最佳提取條件為A3B1C1D3，即提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為120 min，料液比為 1 ∶20（g/mL）。

2.4 枇杷核中多酚含量的測定

稱取5份1.2.1中的枇杷核樣品1g（精確到0.1mg），按照優(yōu)化后的條件即提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為 120min，料液比為 1∶20（g/mL），進(jìn)行超聲輔助提取。提取后定容至50 mL，用移液管取1.00 mL進(jìn)行顯色測定。最終結(jié)果如表8。

表8 多酚測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 The experimental results of polyphenol determination

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取5份1.2.1中的枇杷核樣品1g（精確到0.1mg）放置于磨口三角瓶中，然后各加入1.00 mg的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行超聲輔助提取。提取后定容至50 mL，用移液管取1.00 mL進(jìn)行顯色測定。最終結(jié)果如表9。

3 結(jié)論

利用超聲輔助提取法提取枇杷核中的總多酚，結(jié)果表明提取枇杷核的最優(yōu)條件為提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為120 min，料液比為1∶20（g/mL）。且枇杷核中的多酚的得率在0.2%左右。

表9 回收率實(shí)驗(yàn)Table 9 The results of recoveries

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