謝 放 吳萍民 趙春巧

(蘭州交通大學，蘭州，730070)

一株Agrocybe屬真菌的分離鑒定及生物學特性1)

謝 放 吳萍民 趙春巧

(蘭州交通大學，蘭州，730070)

對一株采自祁連山的疑似Agrocybe屬真菌進行了分離鑒定及生物學特性研究。通過組織分離獲得該菌純培養(yǎng)物，提取其基因組 DNA，以此為模板進行了ITS片段的擴增、測序，及基于ITS序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育分析，同時對該菌進行了生物學特性研究。結(jié)果顯示：從菌絲體中擴增獲得了700 bp左右的ITS片段，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該真菌屬于Agrocybe屬，GenBank登錄號為KF702393。該菌菌絲生長的最適溫度為24 ℃，最適pH為7.0，較適碳氮源為葡萄糖和酵母粉，添加一定量的無機鹽和維生素有助于菌絲的生長。

田頭菇屬；ITS；生物學特性

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-137～142

We isolated and identified fungus from wild environment to study its biological characteristics. The mycelium was isolated from the fruiting body. Genomic DNA was extracted from mycelium, then used as template for the ITS gene PCR amplification, sequencing and phylogenetic analysis. We also studied the biological characteristics of mycelium. About 700 bp fragment was amplified and sequenced. Phylogenetic analysis indicated that the fungi belonged to the genusAgrocybe. GenBank accession number was KF702393. The optimum temperature and pH were 24 ℃ and 7.0, respectively. The optimum carbon sources and nitrogen sources were glucose and dry yeast, respectively. The fungi can advance the growth of mycelium by adding some inorganic salt and vitamins.

KeywordsAgrocybe; ITS; Biological characteristics

田頭菇屬(Agrocybe)是Singer于1986年以Agrocybepraecox(Fr.) Fayod為模式種建立的一類真菌[1]。目前，常見分類是隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、球蓋菇科(Strophariaceae)[2]。該屬是擔子菌中著名的食用兼藥用真菌，具有極大的應(yīng)用價值。從該屬的茶樹菇發(fā)酵液中提取的多糖對鏈脲菌素(STZ)引起的β-胰島細胞破壞具有很好的修復(fù)作用，能顯著地降低STZ引起的葡萄糖濃度和RINm5F細胞中iNOS表達水平，而達到治療糖尿病的作用，用其干燥粉制造的加工食品也具有很好的降血糖作用[3-4]。且從該屬部分菌種中分離的環(huán)化酶不僅具有催化芳香族物質(zhì)的環(huán)氧化和羥基化反應(yīng)，參與物質(zhì)的代謝、苯酚和羥基化產(chǎn)品的生產(chǎn)，還可填補細胞色素P450和常見的血紅素過氧化物酶之間的差距[5-7]，而且作為新型生物傳感器的組成成分，具有高靈敏度和高穩(wěn)定性，可用來測量4-硝基苯酚及其環(huán)化作用產(chǎn)生的酶，以及確定苯胺和對氨基苯酚等，將是一種非常有用的分析試劑[8-9]。同時，諸多的研究員從田頭菇屬中分離出很多新型的倍半萜類、類膽固醇等化學成分，并對它們的結(jié)構(gòu)進行了研究和確定，同時指出它們作為新型的天然化合物，將在新藥物的開發(fā)利用方面具有潛在的藥用價值[10-13]。另外，Liang等[14]和Feng等[15]從楊樹菇中分離到具有抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)片段，分別為AAL和AAL-2，隨后Chen等[16]也分離純化到一種新的具有脫氧核糖核酸酶活性的抗癌蛋白質(zhì)AAD。Imamura等[17]研究表明，從柱狀田頭菇中分離到的半乳糖凝集素是為數(shù)不多的對3’-唾液酸乳糖具有較高親和力的凝集素，利用Asp取代其中的Glu86與3’-唾液酸乳糖的葡萄糖單元相互作用得到的E86D突變，基本上失去了LacNAc和T-抗原的結(jié)合能力，同時保留了對3’-唾液酸乳糖的高親和力，將在細胞工程和糖工程中發(fā)揮重要作用。Wang等[18]研究表明，茶樹菇甲醇提取物(MFAC)介導(dǎo)食用油誘發(fā)活性氧的產(chǎn)生和人肺腺癌CL-3細胞DNA的損傷，能夠通過NF-kB途徑調(diào)控CL-3細胞中環(huán)氧合酶-2的抗食用油基因表達。鑒于田頭菇屬真菌的諸多應(yīng)用價值，本研究對從祁連山區(qū)采集的一株疑似田頭菇屬的野生大型真菌進行組織分離，并通過ITS序列進行鑒定及對其系統(tǒng)發(fā)育分析和生物學特性進行研究，從而對該野生菌株的遺傳地位和生長條件進行解析，為其人工馴化利用及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株ql-7(登錄號：KF702393)，采集并分離于甘肅省張掖市肅南縣與酒泉市肅州區(qū)交界的祁連山中，現(xiàn)保存于蘭州交通大學生物工程種苗研究所。PPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然?；A(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，尿素2 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 L。滅菌條件：121 ℃，30 min。

1.2 方法

形態(tài)學觀察及鑒定：觀察記載菌落特征、菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)，并用數(shù)碼相機拍照，用MOTIC B顯微鏡觀察、測定和拍照微觀產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

DNA提?。涸赑PDA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)10 d，取新鮮培養(yǎng)物，用CTAB法提取總DNA。

PCR擴增：引物ITS1，5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4，5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’。反應(yīng)體系(50 μL)，MgCl24.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，引物ITS1和引物ITS4均為2.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 33.5 μL。

PCR條件：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 45 s，35個循環(huán)，72 ℃10 min。擴增產(chǎn)物在加有EB的1%瓊脂糖凝膠中電泳45 min檢測。

PCR產(chǎn)物的純化和DNA測序由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司完成。

序列分析：相關(guān)種的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫下載；用Clustal X1.83軟件進行DNA序列比對，而后用Seaview軟件對序列作適當手工處理；系統(tǒng)樹構(gòu)建用鄰接法(Mega 4.1軟件)，1 000次bootstrap重復(fù)驗證。

溫度和pH值試驗：采用單因子試驗設(shè)計，將活化好的菌絲體塊分別接種于18、20、22、24、26、28 ℃恒溫避光培養(yǎng)；另接種于pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養(yǎng)基后置24 ℃培養(yǎng)。每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，觀察記錄。

碳氮源試驗：以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中20 g葡萄糖的含碳量為標準，分別以相等含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、葡萄糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，并以不添加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照；以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中2 g尿素的含氮量為標準，分別以相等含氮量的硝酸鉀、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、尿素代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的尿素，并以不添加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照。

無機鹽和維生素的試驗：分別用硫酸鐵、硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸錳代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫酸鎂，并以不加硫酸鎂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照，其中常量元素為0.50 g/L，微量元素為0.06 g/L；以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，分別添加VB1、VB2、VB3、VB6、VB12、VB合進行試驗，其中維生素的量為0.01 g/L。

菌株菌絲將近長滿平皿而未滿平皿時作為測量終點進行菌絲日均長速的測定。菌絲日均長速=[(菌落直徑-6)/2]/培養(yǎng)天數(shù),最后取3個重復(fù)的平均值。采用重量法進行測定[19]菌落干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

該菌子實體較大，菌蓋直徑4～5 cm，厚約2 cm，頂部較平，邊緣展開下彎，淺褐色。菌褶近直生，方向垂直向下，呈深褐色。菌柄長6.5 cm，淺白色至灰褐色，近圓柱形，下端稍彎曲，具菌環(huán)(單環(huán))，菌環(huán)生柄中上部，膜質(zhì)，薄，淡褐色(圖1a)。在PPDA培養(yǎng)基中菌落不平展，白色，邊緣整齊，質(zhì)地緊密，后期時菌絲略帶黃色，背面白色，長時間放置菌落上會出現(xiàn)黃色油狀液滴(圖1b)。菌絲半透明，表面光滑，粗細較均勻，寬2.5～3.0 μm，有隔，無明顯的鎖狀聯(lián)合(圖1c)，具有特殊產(chǎn)孢器，能產(chǎn)生大量的孢子(圖1d、圖1e)；孢子橢圓形，大小(1.5～1.7)μm×(2.3～2.5)μm(圖1f)。

2.2 PCR的擴增結(jié)果

以CTAB法所獲得的菌株基因組DNA為模板，選取2個通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增該菌株的部分序列，結(jié)果如圖2所示，所得的產(chǎn)物片段大小為700 bp左右，條帶明亮清晰，無拖尾現(xiàn)象，表明該方法提取獲得的野生菌基因組DNA質(zhì)量較好，并能夠滿足基于PCR反應(yīng)的后續(xù)分子生物學試驗研究。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

將序列測定的結(jié)果提交至GenBank，登錄號為KF702393。在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進行比對，選取相似性較高的菌株，用Clustal X1.83軟件對菌株ql-7和這些已知種進行了多序列比對，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，菌株ql-7與Agrocybepraecox(EU520254)菌株的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離達到96%，且以100%的支持率處于一個獨特的分支中，因此鑒定該菌屬于Agrocybe屬。

a.子實體；b.菌落形態(tài)；c.菌絲形態(tài)；d、e.產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；f.孢子。

M．分子量標準;1、2.菌絲體基因組DNA中PCR擴增的ITS片段(2次重復(fù))。

圖2 ql-7菌株ITS-PCR電泳結(jié)果

2.4 溫度對菌絲生長的影響

試驗菌在不同溫度下的生長情況見表1。供試菌在18～28 ℃都能生長，但長速和干質(zhì)量存在差異。在18～24 ℃，隨著溫度上升，菌絲長勢越來越好，長速越來越快，積累的干質(zhì)量越來越多；溫度超過24 ℃時，菌絲生長速度減慢，長勢也變?nèi)?，積累的干質(zhì)量量隨之減少，因此，該菌菌絲生長的最適溫度為24 ℃，這與張微思等[20]對茶樹菇的研究結(jié)果相似，而與舒麗等[21]的研究結(jié)果(最適范圍25～30 ℃)略有偏差，分析原因可能與菌株生長的環(huán)境以及菌種不同有關(guān)，筆者所選菌株應(yīng)為中溫型。

表1 溫度對ql-7菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

2.5 pH值對菌絲生長的影響

pH試驗結(jié)果表明(表2)：供試菌在pH值4.0～9.0的范圍內(nèi)均能生長，但不同pH值下菌絲的生長狀況有較大差異，pH值低于5.0時，培養(yǎng)基凝固性不好，菌絲生長緩慢；pH值大于7.0時，菌絲稀疏且老化，推測是不適的pH影響了酶活性基團的構(gòu)象，并改變了底物的特性，對菌絲造成脅迫所致。因此，適宜的pH值為5.0～7.0，其中pH值為7.0時菌絲的生長速率和干質(zhì)量均達最大，并與其他梯度相比具有顯著性差異，所以pH=7.0是菌絲最適生長的酸堿度。這與張松[22]對柱狀田頭菇的研究結(jié)果一樣，而與呂明亮等[23]的研究結(jié)果存在差異，原因可能是該菌在長期的進化過程中為適應(yīng)當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境而進化出對酸堿度范圍的耐受性。

圖3 依據(jù)ITS基因序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(自展值為1 000次)

pH值日均長速/mm·d-1菌落干質(zhì)量/mg4.0(0.70±0.03)dC (53.12±1.08)cCD5.0(0.98±0.04)bcB(79.46±2.34)bBC6.0(1.07±0.06)abAB(86.06±3.01)bAB7.0(1.15±0.03)aA(97.00±4.19)aA8.0(1.04±0.03)bcAB(53.44±2.20)cCD9.0(0.96±0.04)cB(42.24±3.09)cDE

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

2.6 碳源對菌絲生長的影響

試驗菌在不同碳源下的生長情況見表3。該菌能利用多種碳源，但長速和干質(zhì)量存在較大差異。其中以淀粉做碳源時菌絲長速最快，葡萄糖和蔗糖次之，甘露醇最差。但就干質(zhì)量而言，以淀粉做碳源時菌落單薄，積累的干質(zhì)量少，而在以葡萄糖為碳源時菌落質(zhì)地緊密，長勢好，積累的干質(zhì)量最多，并達到極顯著水平。因此，供試菌的最適碳源為葡萄糖，但對甘露醇的利用最差，說明該菌能較好的利用醛糖和酮糖而不容易利用醇糖，對蔗糖和麥芽糖的較好利用也說明了這一點。除了葡萄糖作為單糖能較好的吸收利用外，也與該菌本身的酶系和酶調(diào)節(jié)相關(guān)，如Kakde等[24]研究表明葡萄糖、蔗糖等能促進菌絲中脂肪酶的活性提高，促進菌絲生長。另外，試驗中發(fā)現(xiàn)不同的碳源對菌株干質(zhì)量積累的影響與對菌絲長速的影響不同，分析原因主要與豐富的營養(yǎng)物質(zhì)促使菌落密度的加厚和分枝的增多有關(guān)。如Suzuki等[25]研究表明，合適的碳氮營養(yǎng)素能夠增加真菌菌絲生長所需的部分生長因子，更有利于菌絲的健壯生長。

2.7 氮源對菌絲生長的影響

表3 碳源對ql-7菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

2.8 無機鹽對菌絲生長的影響

試驗菌在不同無機鹽下的生長情況見表5。不同種類的無機鹽對供試菌株菌絲生長的作用效果不同，在培養(yǎng)基中添加硫酸鎂和硫酸錳對菌絲的生長具有一定的促進作用，這與資料中報道的鎂和錳是糖代謝中許多酶類發(fā)揮活性所必需的結(jié)論相一致；而硫酸鈣和硫酸銅無明顯的促進或者抑制作用，可能與添加的濃度大小相關(guān)，添加的量不足以起到作用；硫酸鐵和硫酸鋅對菌絲的生長具有一定的抑制作用，可能與添加的量相關(guān)或者與該菌中這2種礦物質(zhì)的代謝有關(guān)。

表4 氮源對ql-7菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

表5 無機鹽對ql-7菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

2.9 維生素對菌絲生長的影響

試驗菌在不同維生素下的生長情況見表6。

表6 維生素對ql-7菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示差異達0.01和0.05顯著水平。

除VB2對菌絲的生長具有一定的抑制作用外，其余的維生素類都有一定的促進作用，尤其是VB1和VB合對干質(zhì)量的積累具有顯著的促進作用，主要因為VB1的活化形式TPP是中間代謝中一些關(guān)鍵酶的輔酶，VB合中不僅具有VB1的成分，還有真菌類常需要的生物素和葉酸等成分。而該真菌可能不需要VB2或者本身能合成所需的量，再次的添加造成量的增多而導(dǎo)致抑制作用。其他供試維生素類，也具有一定的促進作用，但與對照組相比無明顯差異，說明供試菌可能能合成自身生長所需的這些維生素類，但還需要加大濃度梯度做進一步研究，以明確其機理。

3 結(jié)論與討論

生物學特性研究表明：ql-7菌株不能在無額外添加碳源或氮源的培養(yǎng)基中生長，這在其他大型真菌中極少見報道，以往對灰樹花、茶樹菇、杏鮑菇等多數(shù)大型真菌研究表明在無額外添加碳源或氮源的培養(yǎng)基中真菌都能生長[28-30]，而筆者在2 a的時間里對羊肚菌、雞腿菇、側(cè)耳和荷葉離褶傘等真菌的研究也表明在無額外添加碳源或氮源的培養(yǎng)基中都可見菌絲生長。其原因可能有以下3點。①可能其他真菌類能或多或少的利用瓊脂，而瓊脂作為一種高分子多糖物質(zhì)可能會提供一定的碳氮營養(yǎng)素，而試驗菌無法利用瓊脂而不生長。②接種塊本身就帶有少量的碳氮營養(yǎng)成分，也可能是大部分真菌能耐極貧瘠營養(yǎng)而生長，而供試菌耐貧瘠營養(yǎng)的條件很差，屬于富營養(yǎng)真菌。③王鐳等[31]曾報道柱狀田頭菇在無氮的培養(yǎng)基中不能生長，認為與柱狀田頭菇具有較高的蛋白酶活性有關(guān)，供試菌會不會存在相類似的現(xiàn)象，還有待進一步對其酶活性進行研究。

通過對供試菌的形態(tài)學描述可知，該種與褐色田頭菇(Agrocybebrunneola(Fr.) Bon,Docums.)在子實體大小、顏色、菌柄顏色、菌環(huán)位置等形態(tài)特征上相似，但后者孢子較大，達(12.7～15.7)μm×(5.4～7.8)μm，且形狀呈現(xiàn)長紡錘形、近紡錘形至長橢圓形[32]，而供試菌孢子大小為(1.5～1.7)μm×(2.3～2.5)μm，并且多數(shù)橢圓形。培養(yǎng)特性則表明，供試菌與報道的田頭菇屬的一些菌具有相似的生長溫度和酸堿度以及營養(yǎng)特性[20，22-23]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該供試菌與田頭菇(Agrocybepraecox)菌株的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離達到96%，且以100%的支持率處于一個獨特的分支中，因此鑒定該菌屬于Agrocybe屬。但遺憾的是未能查閱到與之親緣關(guān)系最近的Agrocybepraecox的菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的描述，不能將二者做以比較，但與其他田頭菇的子實體形態(tài)和孢子的大小等特征做比較，并結(jié)合培養(yǎng)特性和分子鑒定結(jié)果，確定供事菌為Agrocybe屬中的一個新種。

綜合形態(tài)分析和分子鑒定結(jié)果以及生物學特性研究可以得到如下結(jié)論：供試菌屬于Agrocybe屬，其最適菌絲生長溫度為24 ℃，最適pH值為7.0，最適碳、氮源分別為葡萄糖和酵母粉，添加一定量的硫酸鎂和硫酸錳對菌絲生長具有促進作用，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定量的維生素也有助于菌絲更好地生長。

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Isolation, Identification and Biological Characteristics of a Wild Fungus of GenusAgrocybe/

Xie Fang, Wu Pingmin, Zhao Chunqiao(Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, P. R. China)//

謝放，男，1962年5月生，蘭州交通大學化學與生物工程學院，副教授。E-mail：xfrankf@163.com。

2013年11月2日。

S646.9

1) 甘肅省科技支撐項目(212256)。

責任編輯：程 紅。