陳雪鵑

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

孫 明 菅 琳 李賢利 張啟翔

(花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室(北京林業(yè)大學(xué))) (國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué)))

部分菊屬植物及其近緣種的胚拯救與雜種鑒定1)

陳雪鵑

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

孫 明 菅 琳 李賢利 張啟翔

(花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室(北京林業(yè)大學(xué))) (國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué)))

為了提高菊花遠(yuǎn)緣雜交育種效率，對3個常規(guī)雜交育種方法難以獲得雜種后代的組合：甘菊ב蝶影’、小紅菊×甘菊以及磯菊×太行菊進(jìn)行幼胚拯救，并對獲得的雜種進(jìn)行了AFLP分子早期鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果表明，3個常規(guī)有性雜交難以或僅能獲得較少雜種的雜交組合，通過幼胚拯救均可獲得雜種后代，極大地提高了育種效率。較適宜的幼胚拯救時期為授粉后16～24 d；較適宜的培養(yǎng)基為MS+BA1.5 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1；AFLP及形態(tài)學(xué)鑒定證實了雜種的真實性。

菊屬；近緣種；胚拯救；AFLP；雜種鑒定

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-74～79，86

We studied embryo rescue and hybrid identification of three cross combinations (Chrysanthemumlavandulifolium×C.morifolium‘Die Ying’,C.chanetii×C.lavandulifolium,Ajaniapacifica×Opisthopappustaihangensis) to select the interspecies hybrid between chrysanthemum efficiently. The offspring of these three combinations could only be obtained by embryo rescue rather than conventional cross breeding. The best time for embryo rescue was 16-24 days after pollination. MS medium supplemented with BA 1.5 mg/L and NAA 2.0 mg/L was the optimal medium for germination and growth. AFLP and morphological analysis proved the reliability of the hybrids.

KeywordsChrysanthemum; Related species; Embryo rescue; AFLP; Hybrids identification

菊花(Chrysanthemummorifolium)是中國傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一。菊花原產(chǎn)中國，在中國有3 000多年的栽培歷史[1]。因其在百花紛紛枯萎的秋冬季節(jié)傲霜開放，而被賦予豐富高潔的花文化，代表著不畏寒霜的氣節(jié)。同時，由于其繁茂美麗的花朵，多變奇異的花形，以及較強(qiáng)的適應(yīng)性和廣泛的用途(可食、可釀、可飲、可藥)，菊花在世界園藝觀賞花卉中占有極其重要的地位。多個國家都開展了菊花的新品種選育工作，我國有超過4 000個菊花品種，而全球的品種總數(shù)超過了2萬以上[2]。

菊花栽培品種的優(yōu)良性狀雖然很多，但是在抗逆、抗病蟲害等抗性方面還存在不足，限制了其產(chǎn)量和品質(zhì)的提高及其應(yīng)用地域范圍的拓展[3-4]。近年來，國內(nèi)外菊花新品種選育工作中，多利用具有優(yōu)良抗性的菊屬野生種及其近緣屬種與栽培菊花進(jìn)行雜交育種來進(jìn)行菊花品種的抗性改良。而在此過程中存在的遠(yuǎn)緣雜交障礙，則嚴(yán)重地阻礙了育種進(jìn)程。利用胚拯救技術(shù)，可以有效地克服遠(yuǎn)緣雜交過程中受精后障礙的問題，更加高效地獲取遠(yuǎn)緣雜交后代，縮短育種周期[5]。通過此方法，研究人員已成功獲得了栽培菊花與菊花腦、異色菊、細(xì)裂亞菊等部分野生種的遠(yuǎn)緣雜交后代[6-8]。而本試驗在大量菊屬野生種種間雜交、與近緣野生種雜交、與地被菊栽培品種的雜交育種試驗基礎(chǔ)上，選取常規(guī)雜交育種難以獲得雜交后代的3個雜交組合，利用幼胚拯救技術(shù)獲取雜交后代，并對獲得的后代進(jìn)行AFLP早期鑒定及相關(guān)的形態(tài)學(xué)鑒定，以期為將更多優(yōu)良野生資源引入菊花種質(zhì)資源庫、提高菊花新品種選育效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在前期大量的地被菊雜交育種試驗中，選取使用常規(guī)雜交育種手段不易或僅能獲取少量雜交后代的雜交組合，利用熒光顯微鏡觀察其花粉在柱頭上的萌發(fā)過程，挑選出3個有部分花粉能正常萌發(fā)伸長至子房的雜交組合作為本試驗的供試材料，分別是甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)ב蝶影’(C.morifolium‘Die Ying’)(雜交親和指數(shù)5.5)、小紅菊(C.chanetii)×甘菊(雜交親和指數(shù)1.9)、磯菊(Ajaniapacifica)×太行菊(Opisthopappustaihangensis)(雜交親和指數(shù)0.2)。其中，親本甘菊和小紅菊為華北地區(qū)常見野生種，具有較強(qiáng)抗性，甘菊的花量極大，而小紅菊的花朵觀賞性較強(qiáng)；磯菊的葉片深綠，背面密被白色短絨毛，葉緣有白邊，是近年來江浙一帶園林中常用的觀葉植物；太行菊為我國特有種，植株低矮緊湊，花朵潔白美麗，整株具有芳香，且具有較強(qiáng)的抗旱性。所選的親本野生種都擁有園林觀賞花卉所需要的優(yōu)良特性，具有抗性育種潛力。所有材料均由國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))小湯山菊花種質(zhì)資源圃提供。

1.2 遠(yuǎn)緣雜交

試驗于2009年10月—2011年5月進(jìn)行。在親本進(jìn)入盛花期時挑選生長健壯、無病蟲害的植株作為試驗材料。將3個組合的母本人工去雄并套袋進(jìn)行隔離，在舌狀花微開時對父本進(jìn)行套袋，待其盛開時于晴朗無風(fēng)天的09：00—12:00采集花粉，并于09:00—15:00進(jìn)行授粉，同一花序初次授粉2 d后重復(fù)授粉1次。

1.3 子房培養(yǎng)

由于菊花幼胚較小，不易取出且取出時易受傷害，因而在菊花中常采用子房培養(yǎng)代替胚培養(yǎng)[5-6，9]。

1.3.1 基因型及授粉后不同接種時期對子房培養(yǎng)的影響

分別取3個雜交組合授粉后4、8、12、16、20、24 d的花序，每次各處理3～5朵。取邊緣舌狀花的子房(磯菊花序邊緣無舌狀花或極少，取管狀花子房)以75%酒精表面消毒30 s后用0.1%升汞處理5 min，無菌水沖洗5～6次后將子房接入MS+BA2.0 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1培養(yǎng)基[6]，每瓶接種10個，每處理重復(fù)5瓶，觀察胚萌發(fā)情況并統(tǒng)計萌發(fā)率和出苗率。出愈率=(總愈傷組織塊數(shù)/接種子房數(shù))×100%；成苗率=(幼苗數(shù)/接種子房數(shù))×100%。

1.3.2 不同激素配比培養(yǎng)基的篩選

根據(jù)1.3.1試驗結(jié)果，選擇3個組合的最佳接種時期進(jìn)行子房培養(yǎng)，將子房接種到不同激素配比的培養(yǎng)基內(nèi)，4種培養(yǎng)基組成成分分別為A：MS+BA1.5 mg·L-1+NAA1.5 mg·L-1；B：MS+BA1.5 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1；C：MS+BA2.0 mg·L-1+NAA1.5 mg·L-1；D：MS+BA2.0 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1。每瓶接種10個，每處理重復(fù)5瓶。子房接種產(chǎn)生的愈傷組織或是直接萌發(fā)的幼苗轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，每月繼代1次，待長至3～4 cm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根，繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基參照李辛雷等[6]的設(shè)置。培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，每日光照12～14 h，光照度1 700～2 000 lx。獲得的小苗先于溫室栽植煉苗，后定植于大田。

1.4 雜交后代鑒定

AFLP鑒定：取雜交組合中親本和后代不同植株上新鮮的幼嫩葉片，液氮混合磨樣，采用Tiangen[天根生化科技(北京)有限公司]植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA。AFLP反應(yīng)體系、使用儀器和條件設(shè)置均與Chen et al.[10]相同，雜種鑒定依據(jù)孫明[11]的方法。試驗所用接頭、引物、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、Smart ladder、Gel Red、瓊脂糖等藥品及試劑均購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測挑選出多態(tài)性高的引物組合，在選定組合的Mse I引物的5’端添加熒光修飾(5’-FAM藍(lán)色，5’-HEX綠色)，再次進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，生成的熒光PCR產(chǎn)物采用ABI 3730 DNA自動測序儀(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測，利用軟件GeneMarkerV1.65獲取條帶信息并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

形態(tài)學(xué)鑒定：將獲得的雜種小苗于溫室內(nèi)煉苗后定植于大田，于秋季盛花期對雜種后代遺傳性狀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計，性狀登記均按莫官站等[12]進(jìn)行，花色標(biāo)準(zhǔn)參照英國皇家園藝學(xué)會色譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型及授粉后不同接種時期對子房培養(yǎng)的影響

選取授粉后不同時間(days after pollination,DAP)的子房進(jìn)行接種培養(yǎng)(表1，圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從親本基因型來看，3個組合中，二倍體野生種甘菊和地被菊品種‘蝶影’雜交的平均出愈率和成苗率都最高，分別為14.3%和4.7%；六倍體野生種小紅菊和甘菊雜交組合居中，分別為8.0%和1.7%；而亞菊屬磯菊×太行菊最低，只有6.3%和1.0%。不同基因型的3個雜交組合出愈率和成苗率差距較大，這一結(jié)論與已有研究結(jié)果[6]一致。本試驗的3個組合出愈率和成苗率大小與有性雜交試驗時的親和指數(shù)高低成正相關(guān)，表明二者可能均主要受雜交親本的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不同影響。

從授粉后不同接種時期看，3個組合在DAP4、8 d時進(jìn)行子房培養(yǎng)，均沒有得到愈傷組織和幼苗；在12 d時培養(yǎng)均沒有獲得小苗，只有2個組合有4.0%的出愈率。甘菊ב蝶影’雜交，授粉后16 d時出愈率最高，為42.0%，成苗率最高為DAP 20 d時的10%；雜交組合小紅菊×甘菊在DAP 20 d時既有最高出愈率(26.0%)，也有最高成苗率(8.0%)；以磯菊為母本和野生二倍體太行菊雜交，DAP 24 d時有最高出愈率(18.0%)和最高成苗率(4%)。從平均出愈率和成苗率看，DAP 20 d時有最高的平均出愈率和成苗率，分別為22.0%和6.7%。從結(jié)果可見，3個雜交組合的最佳子房培養(yǎng)時期略有不同，組合甘菊ב蝶影’為DAP 16～20 d，組合小紅菊×甘菊為DAP 20 d，而磯菊×太行菊的最佳培養(yǎng)時期則在DAP 24 d左右。

表1 基因型及授粉后不同接種時間對子房培養(yǎng)的影響

A.胚萌發(fā)；B.生根培養(yǎng)；C.繼代培養(yǎng)。

2.2 不同激素配比培養(yǎng)基對子房培養(yǎng)的影響

選取3個雜交組合授粉后的最佳培養(yǎng)時期進(jìn)行子房培養(yǎng)，接種到4種不同激素配比的培養(yǎng)基上(表2)，結(jié)果表明：除雜交組合磯菊×太行菊在A中無法直接得到小苗外，其余組合均可在4種培養(yǎng)基中獲得愈傷組織和小苗。在培養(yǎng)基B中，3個組合的出愈率和成苗率都最高，平均出愈率(26.7%)是培養(yǎng)基A的3.7倍，平均成苗率(12.7%)是培養(yǎng)基A的4.7倍。3個雜交組合在培養(yǎng)基C中的出愈率、成苗率差距均不大。甘菊ב蝶影’在培養(yǎng)基B中的出愈率、成苗率均最高，分別達(dá)34.0%、18.0%；雜交組合小紅菊×甘菊和磯菊×太行菊在培養(yǎng)基A中出愈率最低，為6.0%。由試驗結(jié)果可知，對供試的3個雜交組合來說，培養(yǎng)基MS+BA1.5 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1培養(yǎng)效果較好。

表2 不同激素配比培養(yǎng)基對子房培養(yǎng)的影響

注：A～D培養(yǎng)基成分見1.3.2；DAP.授粉后不同時間。

2.3 AFLP的多態(tài)性及雜種鑒定

2.3.1 AFLP的多態(tài)性分析

在子房培養(yǎng)獲得的雜種小苗中，雜交組合甘菊ב蝶影’和小紅菊×甘菊的子代各隨機(jī)挑選10株，磯菊×太行菊的子代隨機(jī)挑選5株進(jìn)行AFLP鑒定。首先，用6組不同的DNA樣品從79對EcoR I和MseI選擇性引物組合中篩選出10個帶型清晰且多態(tài)性高的引物對(圖2中引物組合5)。用這10對引物對3個雜交組合的親本和隨機(jī)挑選的雜種后代共31組DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增(表3)。由結(jié)果可見，篩選出的10對引物組合均獲得了清晰可辨且多態(tài)性較高的條帶結(jié)果，不同的引物組合PCR擴(kuò)增譜帶的多少均不相同。引物組合E-AGG/M-CAG擴(kuò)增的條帶最多(1 258條)，擴(kuò)增條帶最少的引物是E-TTA/M-CTG(692條)。引物組合E-ACA/M-CAG擴(kuò)增的條帶多態(tài)性最高，為89.64%；E-TTC/M-CAG擴(kuò)增的條帶多態(tài)性最低，為61.84%。10對引物總共擴(kuò)增出條帶9 908條(70-600 bp之間)，其中多態(tài)性條帶為7 036條，占71.01%，說明所選引物組合的擴(kuò)增效果較好。

M.DL2000；引物組合1～5.6個樣品的5個EcoR I/MseI引物對擴(kuò)增條帶。

圖2 引物篩選的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3.2 雜種的AFLP鑒定

AFLP標(biāo)記技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，因其DNA使用量較少，能夠在早期對雜種幼苗進(jìn)行鑒定，不影響植株的生長發(fā)育，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于雜種鑒定工作中[12-14]。從本試驗的10對引物擴(kuò)增結(jié)果分析(表4)來看，雜種的擴(kuò)增條帶主要有以下4種類型：雜種與父本共有特異條帶(MS)、雜種與母本共有特異條帶(FS)、雜種與雙親共有條帶(BS)以及雜種特有條帶(H)。這些結(jié)果表明，供試雜交后代為親本雜種無疑，既具有親本的特征，同時也因為重組出現(xiàn)了新的特點。從子代與親本共有的條帶數(shù)來看，甘菊ב蝶影’的雜種與雙親共有條帶最多(平均每個子代與親本共有96.7條)；小紅菊×甘菊居中(51.9條)；磯菊×太行菊最少，只有29.0條。而與之成反比的是雜種自身特有的條帶數(shù)量，由大到小的排序是磯菊×太行菊、小紅菊×甘菊、甘菊ב蝶影’。這一變化趨勢表明，雜交親本的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，則雜種與父母共有的條帶數(shù)越少，雜種更傾向于具有更多的特異條帶。

表3 雜交親本及雜種后代10對AFLP引物的多態(tài)性分析

根據(jù)子代中出現(xiàn)父、母本特異條帶的多少，子代可劃分為偏母本型(子代出現(xiàn)母本特異條帶數(shù)多于父本特異條帶數(shù))和偏父本型(子代出現(xiàn)父本特異條帶數(shù)多于母本特異條帶數(shù))，本試驗中絕大部分雜種都是偏母本型，只有小部分的子代為偏父本型，這一結(jié)論與已有的相關(guān)研究一致[11，15]。

2.4 雜種形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)過對定植于大田的親本及雜種后代植株進(jìn)行觀賞性狀的觀察和記錄，結(jié)果(表5；圖3)表明，除組合小紅菊×甘菊的后代在冠幅上出現(xiàn)了明顯的超親現(xiàn)象外，雜種的株高、冠幅、舌狀花數(shù)量、筒狀花數(shù)量和花徑大部分介于兩個親本之間，大部分父本特有而母本沒有的特征在子代有所體現(xiàn)?；ㄉ希s種相較于親本出現(xiàn)了更多的花色，表明雜交使得子代花色出現(xiàn)廣泛的分離。同時，3個雜交組合的主要觀賞性狀都表現(xiàn)出明顯的偏母性遺傳特點，即子代的主要觀賞性狀更加傾向于母本。

3 結(jié)論與討論

近年來，國內(nèi)外的菊花育種工作中，除了傳統(tǒng)的自然雜交、人工雜交和芽變選種外，多倍體育種、輻射誘變育種和基因工程等方法也被廣泛應(yīng)用。其中，雜交育種方式仍然是定向培育菊花新品種最普遍和最有效的方法[16]。菊花品種目前存在的問題是普遍抗逆性較差，而中國擁有大量具有優(yōu)異抗性的菊花野生資源，因而，如何將野生資源的優(yōu)良抗性基因?qū)刖栈ㄆ贩N將是抗性育種中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。在此過程中，有部分菊屬植物和其近緣屬種親和性較好，能夠直接通過有性雜交獲得雜種后代[17-18]；借助蒙導(dǎo)授粉、短截花柱、多倍體育種等方式也可以在一定程度上克服雜交障礙獲得雜種[11，19]；而一些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的屬種雜交時則只能通過胚拯救的方式獲得雜種[20]。由此可見，親本基因型的差異對能否有效取得雜種具有決定性的作用。因而，在進(jìn)行菊花育種工作時，選配親緣關(guān)系較近的親本將極大地縮短育種進(jìn)程；而需要用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的親本進(jìn)行雜交育種時，采用胚拯救的方法可以更有效地獲得遠(yuǎn)緣雜交后代。

表4 雜交親本及雜種后代的AFLP指紋條帶分析

注：1-1～1-10.甘菊ב蝶影’的雜交后代；2-1～2-10.小紅菊×甘菊的雜交后代；3-1～3-5.磯菊×太行菊的雜交后代。

表5 雜交親本及雜種后代的主要觀賞性狀分析

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

孫春青等[21-22]以甘菊和野路菊為父本，栽培菊花品種‘金陵黃玉’和‘奧運(yùn)天使’為母本進(jìn)行種間遠(yuǎn)緣雜交，發(fā)現(xiàn)受精后胚大量敗育是其雜交失敗的主要原因，障礙主要發(fā)生在球型胚至心型胚之間。李辛雷等[6]利用異色菊與栽培菊花品種進(jìn)行的試驗中得出授粉后13～18 d為子房培養(yǎng)的最佳時期。本試驗中，3個雜交組合的最優(yōu)胚培養(yǎng)時期從DAP 16～24 d各不相同，表明不同雜交組合獲得的雜種胚其發(fā)育速度是有區(qū)別的。胚培養(yǎng)中，在適宜的胚齡進(jìn)行胚培養(yǎng)才能有效的獲得雜種后代，過早難以培養(yǎng)成功，過晚則胚敗育[23]。因而在對不同基因型親本的雜交胚進(jìn)行胚拯救時，結(jié)合細(xì)胞學(xué)研究確定雜種胚的發(fā)育階段將有助于提高胚培養(yǎng)的效率。

1-1.♀甘菊；1-2.♂‘蝶影’；1-3.甘菊ב蝶影’雜種；2-1.♀小紅菊；2-2.♂甘菊；2-3.小紅菊×甘菊雜種；3-1.♀磯菊；3-2.♂太行菊；3-3.磯菊×太行菊雜種。

圖3 雜交親本及雜種形態(tài)

Serge[24]提出，低溫處理可以促進(jìn)胚培養(yǎng)時幼胚的萌發(fā)，而宋維秀[25]、熊友華[26]等的研究也證實，經(jīng)過低溫處理的幼胚萌發(fā)率有顯著提高。菊花中目前還沒有相關(guān)報道，這一規(guī)律在菊花的幼胚拯救中是否適用有待進(jìn)一步研究。

已有的研究中，鑒定菊花雜交后代最常用的方法是形態(tài)學(xué)鑒定。但是由于多年大量的雜交育種工作，栽培菊花品種的基因高度雜合，在進(jìn)行雜交育種的過程中，雜交后代的觀賞性狀會出現(xiàn)廣泛的分離，單純從形態(tài)學(xué)上有時很難確定雜種的真實性。近年來，用形態(tài)學(xué)結(jié)合細(xì)胞學(xué)、RAPD分子標(biāo)記等方法來鑒定菊花雜種真實性[27]彌補(bǔ)了這一缺陷。本試驗中應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，同樣有效地證實了雜種的真實性。同時，由于AFLP標(biāo)記方法具有豐富的多態(tài)性，還可以對材料的親緣關(guān)系進(jìn)行有效的分析[10]，對將來的雜交育種親本選擇具有指導(dǎo)意義。

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Embryo Rescue and Hybrids Identification among Species and Cultivars ofChrysanthemumand Its Related Genera/

Chen Xuejuan(Beijing Forestry University, Beijing 10083, P. R. China); Sun Ming, Jian Lin, Li Xianli(Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding, Beijing Forestry University); Zhang Qixiang(National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing Forestry University)//

陳雪鵑，女，1984年10月生，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，博士研究生。

張啟翔，國家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))、花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室(北京林業(yè)大學(xué))、北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，教授。E-mail: zqxbjfu@126.com。

2014年1月24日。

S682.1+1； Q943.1

1) “十二五”科技支撐計劃(2012BAD01B07、2013BAD01B07)、北京市共建項目專項(2013BJFU)。

責(zé)任編輯：任 俐。