徐勝，鐘其頂，王道兵

（1.農(nóng)夫山泉股份有限公司，浙江杭州310007；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京100027）

目前國家標準GB/T 21731-2008《橙汁及橙汁飲料》雖然明確規(guī)定了非復原橙汁和復原橙汁的定義，尚未建立非復原橙汁和復原橙汁的有效鑒別配套技術方法。國際上通常采用橙汁中水的氧（18O/16O，記作δ18O）同位素比值作為NFC橙汁真實性鑒別特征指標[1-6]。如歐洲果蔬汁協(xié)會（AIJN）采用橙汁中水的δ18O值作為NFC橙汁和FC橙汁鑒別指標，其中美國官方分析化學家協(xié)會（AOAC）和歐盟委員會（CEN）先后制訂了測定（濃縮）橙汁水中δ18O的檢測方法標準。國內(nèi)牛麗影和鐘其頂?shù)热顺醪教接懥怂笑?8O在國內(nèi)NFC橙汁真實性識別中的應用，研究表明NFC橙汁水中δ18O明顯區(qū)別于復原橙汁[7-8]。

目前，AOAC和CEN等測定橙汁水中δ18O的標準方法主要采用離線二氧化碳-水平衡法[9]，但該分析方法不僅存在樣品量大，勞動強度大，對實驗人員的要求高等特點，且無法實現(xiàn)全自動進樣，分析效率低，難以滿足大規(guī)模連續(xù)測定。在線二氧化碳-水平衡系統(tǒng)在近年來得到快速發(fā)展，Debajyoti Paul和Grzegorz Skrzypek研究了不同因素對GasBench-IRMS測定二氧化碳中δ18O時穩(wěn)定性與準確性的影響，并對實驗條件進行了優(yōu)化[10]；孫青等人應用GasBench II-IRMS分析天然水樣中δ18O，穩(wěn)定性與準確性均比較理想[11]；張琳等人對離線水平衡-雙路進樣法和GasBench IIIRMS進行了比較，結果表明兩種方法測定水中δ18O的精密度和準確度基本一致，均能得到較好的分析數(shù)據(jù)[12]。本文通過優(yōu)化方法參數(shù)，建立GasBench-IRMS測定橙汁中（尤其是新鮮橙汁）水的δ18O方法，探討在大規(guī)模連續(xù)進樣測定橙汁中水的δ18O在線分析系統(tǒng)。

1 材料方法

1.1 儀器和主要試劑

GasBenchII前處理裝置配備：GCPAL自動進樣器，PoraPlotQ色譜柱（25m×0.32mm），恒溫樣品盤（溫度精度±0.1℃），硼硅酸鹽反應瓶（12mL），進樣針和吹氣針。

檢測器為Delta V advantage（美國Thermo Finnigan公司），儀器控制軟件為ISODATE 3.0。

高純He、CO2標準氣和0.3%CO2+He混合氣，銅絲，活性碳粉末，乙醇（色譜純）。

1.2 實驗樣品

新鮮橙子采自安遠養(yǎng)生堂臍橙種植基地，去皮后榨汁，用三層紗布過濾后待測。

1.3 實驗方法

設定恒溫樣品盤溫度27℃，He壓力為80 kPa。在樣品瓶中加入銅絲和活性炭，加入樣品后放入恒溫樣品盤。固定進樣針和吹氣針，設定自動進樣器程序，充0.3%的CO2+He混合氣10 min，帶走瓶中的空氣。設定樣品充氣與樣品分析之間的間隔，使氣體CO2與水中氧發(fā)生同位素交換[13]。用質譜儀測定平衡后的CO2同位素比值。

1.4 結果表示

采用相對測量法表示物品中18O/16O，結果以δ（千分差，‰）表示

式中：R樣品為樣品中18O與16O的比值；R標準為標準物質VSMOW中18O與16O比值，18O/16O=（2 005.20±0.43）×10-6。

1.5 數(shù)據(jù)校正

樣品測定過程中插入質控水樣和標準水樣，依據(jù)Stephen等[14]報道的VSMOW/SLAP校正法進行校正。

2 結果與討論

2.1 參考氣分析精度

連續(xù)流-穩(wěn)定同位素比值質譜儀測定時，參考氣分析精度的好壞直接影響樣品的分析精度和準確度。對于水中氧同位素分析，控制二氧化碳參考氣同位素分析內(nèi)精度至關重要。連續(xù)10次通入?yún)⒖細猓瑴y定標準偏差（σ）＜0.015‰（見表1）；改變參考氣進樣量（以信號強度表示），測定值的變化率為-0.035‰/V（見表2）。表1和表2數(shù)據(jù)表明儀器的內(nèi)精度符合測定要求，而CO2的進樣量在1 V～10 V變化時，δ18O分析結果不受影響。

系統(tǒng)內(nèi)精度數(shù)據(jù)見表1，信號強度對δ18O的影響見表2。

表1 IRMS系統(tǒng)內(nèi)精度δ18O（‰）Table 1 Inter-precision for δ18O analysis

表2 δ18O（‰）與信號強度的關系Table 2 Influence of intensities on the determination of δ18O

2.2 進樣系統(tǒng)穩(wěn)定性

樣品瓶內(nèi)氣體由進樣針導入GasBench，CO2經(jīng)色譜柱分離純化后由八通閥導入IRMS中，連續(xù)進樣10次，測定值的標準偏差1-σ＜0.08‰（見表3），滿足同位素測定要求。

GasBench II-IRMS測定δ18O的進樣穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表3。

表3 進樣系統(tǒng)穩(wěn)定性δ18O（‰）Table 3 Inlet system stability for δ18O analysis

2.3 影響因素分析

2.3.1 樣品瓶氣密性

文獻[10]報道超過24 h時瓶內(nèi)CO2中δ18O呈現(xiàn)偏重趨勢，即反應瓶氣密性變化導致瓶內(nèi)氣體滲漏繼而出現(xiàn)同位素分餾。本實驗表明52 h之內(nèi)CO2中δ18O值恒定（見圖1），這說明本研究所選擇的反應瓶能夠保證至少52 h內(nèi)不出現(xiàn)同位素分餾。

測定時間對δ18O的影響見圖1。

圖1 反應瓶氣密性驗證Fig.1 Gastight test of vial

2.3.2 樣品體積的影響

孫青的研究表明樣品水體積對δ18O的分析結果有明顯干擾，當樣品水量較大時，測量值受體積的影響較小，而樣品水量較小時，測量值受體積的影響較大[11]。本研究分別向樣品瓶中加入0.2、0.5、1 mL橙汁樣品，結果（見表4）表明不同體積的橙汁樣品對水中δ18O的分析結果沒有明顯干擾，即由于橙汁樣品水中氧的量遠遠超過平衡物質CO2物質的量，平衡體系中CO2的初始同位素比值對分析結果沒有影響。

樣品體積對δ18O的影響見表4。

表4 樣品體積對水中δ18O（‰）測定的影響Table 4 Influence of sample volume on δ18O determination

2.3.3 平衡時間的選擇

CO2/He混合氣與水發(fā)生氧同位素交換，分別在12、16、20、24、32、40、48、72 h 時測定，反應時間在12 h～24 h時測得的氧同位素值比較偏負，且呈現(xiàn)逐漸偏正的趨勢，這表明水與CO2還未完全達到同位素平衡；反應24 h～72 h時測得的結果比較接近（見圖2）。

圖2 反應時間對葡萄酒水中δ18O的影響Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O determination

2.3.4 乙醇及發(fā)酵對橙汁水中δ18O測定的影響

GasBench-IRMS的應用優(yōu)勢在于可不間斷測定大量樣品，由于同位素交換反應和樣品測定間隔的緣故，樣品在反應瓶中等待最少24 h、最多48 h才能進行測定，在此過程中橙汁（尤其是鮮橙汁）存在發(fā)酵的可能，然而發(fā)酵產(chǎn)生的CO2會嚴重影響水中δ18O的測定[15]。為研究橙汁自然發(fā)酵對測定的影響，分別對橙汁樣品按表5進行處理。

果汁發(fā)酵產(chǎn)生的CO2對δ18O的影響見表5。

表5 發(fā)酵對水中δ18O測定的影響Table 5 Influence of fermentation on the determination of δ18O

結果表明A組（反應瓶內(nèi)有橙汁和CO2-He混合氣）中CO2的信號強度明顯增加，但增加的程度不同，這可能是由于待測過程中的先后順序不同導致反應瓶內(nèi)樣品的發(fā)酵程度有差異；B中加入了乙醇，CO2的含量相對穩(wěn)定且信號強度僅有9.5 V；向C和D中加入相同質量的酵母，另向C中加入乙醇，由表5可知D中CO2的信號強度明顯大于50 V，超過了IRMS的測定線性范圍；相對D，C中CO2信號強度顯著降低，僅比B高一點，這說明乙醇抑制酵母發(fā)酵的作用顯著。

為驗證乙醇對δ18O測定的影響，配制體積分數(shù)為0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，測定其水中δ18O（見表6），結果乙醇濃度在0%～20%范圍內(nèi)時不影響水中δ18O的測定穩(wěn)定性及結果準確性，因此可選用乙醇作為橙汁水中δ18O測定過程中的發(fā)酵抑制劑。

乙醇濃度對水中δ18O測定的影響見表6。

表6 乙醇溶液中的水中δ18OTable 6 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.4 方法穩(wěn)定性

采用IRMS與GasBench II聯(lián)用，利用CO2-H2O平衡在線連續(xù)分析新鮮橙汁中氧穩(wěn)定同位素組成，方法為：恒溫樣品盤溫度為27℃，He壓力80 kPa，0.5 mL橙汁樣品中加入活性碳、銅絲和0.05 mL乙醇后與0.3%CO2+He混合氣與平衡24 h～48 h，用質譜儀測定同位素交換平衡后CO2中δ18O，用標準水樣校正測定結果。

2.4.1 精密度

對同一橙汁樣品重復測定5次（見表7），橙汁水中δ18O的1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測定果汁水中δ18O的精密度。

表7 水中δ18O（‰）精密度試驗結果Table 7 The precision of δ18O-value analysis of water in juices

2.4.2 再現(xiàn)性

選擇同一橙汁樣品每隔一周測定一次（見表8），1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測定果汁水中δ18O的再現(xiàn)性結果見表8。

表8 水中δ18O（‰）再現(xiàn)性試驗結果Table 8 Reproducibility of δ18O-value of water in juices

由此可知，本法測定新鮮橙汁水中δ18O的精密度與再現(xiàn)性指標均比較理想，符合樣品水中δ18O測定的要求。

3 結論

本研究建立了GasBench II-IRMS測定橙汁氧同位素組成的在線分析方法：應用GasBench II設備對樣品進行水-CO2平衡，通過加入乙醇可有效抑制待測過程中果汁發(fā)酵，最后用IRMS測定CO2中δ18O并計算得出樣品水中δ18O。該法測定精密度和穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性高，相對于其他方法操作簡便、分析快速，適合果汁行業(yè)和檢測系統(tǒng)的大規(guī)模樣品測定，為我國建立NFC果汁技術標準體系提供科學方法支撐。

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