薛蓓，裴建新，劉振東，羅章，韋宇拓

（1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000；2.廣西南寧市疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧530023；3.廣西大學(xué)微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530003）

α-淀粉酶（1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1）能夠以淀粉為底物，從淀粉鏈內(nèi)部水解其1，4-α-D-葡萄糖苷鍵。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已研究清楚了α-淀粉酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并已經(jīng)分別從假單胞菌（Pseudomonas stutzeri Mo-19）[1]、米曲霉（Aspergillus oryzae）[2]、枯草桿菌（Bacillus subtilis）[3]、黃單胞菌（Xanthomonas campestuis PV，campestris）[4]等微生物以及動(dòng)物和植物中克隆到α-淀粉酶基因。人們正積極尋找產(chǎn)生α-淀粉酶的新菌株，并用分子生物學(xué)的方法克隆新基因，同時(shí)構(gòu)建基因工程菌高效表達(dá)酶蛋白，廉價(jià)大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶。本工作克隆了一株從廣西象州溫泉中篩選分離得到的可水解淀粉的中度嗜熱菌地芽孢桿菌Geobacillus sp.GXS1的α-淀粉酶基因，并在大腸桿菌JM109（DE3）中成功表達(dá)，用金屬鎳親和層析將重組蛋白進(jìn)行分離純化，對(duì)酶的酶學(xué)性質(zhì)做了初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

Geobacillus sp.GXS1 和 E.coli JM109（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存，pSE380表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 酶和試劑

PrimerSTARDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、各種限制性內(nèi)切酶λDNA/HindIII DNA Marker為大連TaKaRa寶生物工程公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶DpnI購(gòu)自MBI Fermentas公司；小量膠回收試劑盒及小量DNA純化試劑盒Omega biotek公司產(chǎn)品；PCR引物合成和測(cè)序委托上海捷瑞生物公司完成；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Tryptone，0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Yeast extract，1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl。

1.2 方法

1.2.1 Geobacillus sp.GXS1菌株培養(yǎng)及總DNA的提取

將Geobacillus sp.GXS1接種到M9液體培養(yǎng)基中，65℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，然后取3 mL的培養(yǎng)液收集菌體，參考文獻(xiàn)[5]提取總DNA。

1.2.2 質(zhì)粒的提取、酶切、連接和轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒的提取、酶切、連接和轉(zhuǎn)化均按參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.2.3 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶成熟肽基因的克隆

根據(jù)GeneBank已公布的與本研究的α-淀粉酶的相似度較高的α-淀粉酶序列和丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（CBS）的網(wǎng)站通過其SignalP 3.0 Server信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)含有信號(hào)肽的引物：

sense-Primer：5’-ATATCATGAAAATGGGGAACCGGCTCTTTATGCT-3’

antisense-Primer：5’-ATAAAGCTTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCGGCATCCGCTTCGCCCGTT-3’

為了便于與載體連接及定向驗(yàn)證，在上下游分別設(shè)計(jì)了PagI和HindⅢ位點(diǎn)酶切位點(diǎn)（下劃線表示）；為了方便后期鎳柱純化目的蛋白，通過設(shè)計(jì)引物在表達(dá)的目的蛋白中加上組氨酸標(biāo)簽，PCR擴(kuò)增條件為98℃10 s，68℃ 1 min 40 s，完成30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，將擴(kuò)增出目的基因片斷。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

擴(kuò)增得到amy的基因片段用試劑盒純化后，用PagI和HindⅢ內(nèi)切酶進(jìn)行消化，然后與NcoI和HindⅢ酶切過的pSE380載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切電泳正確的并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，篩選得到重組質(zhì)粒命名為pSE-amy。

1.2.5 α-淀粉酶基因的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pSE-amy轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109（DE3），挑取重組子于37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG于37℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h，收集菌體超聲破碎，粗酶液分別經(jīng)Ni-NTA進(jìn)行純化。

1.2.6 α-淀粉酶酶活測(cè)定

淀粉酶活力的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[6]中的Bernfeld法，一個(gè)酶活力單位（1 U）定義為：在65℃、pH7.0條件下，1 min生成1 μmol葡萄糖所需的酶量[6]。

1.2.7 蛋白含量測(cè)定

按照Bradford方法測(cè)定[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以Geobacillus sp.GXS1菌株的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增α-淀粉酶基因，所得PCR產(chǎn)物為1.5 kb左右，與預(yù)期大小相符如圖1（A）。

以BamHI和HindIII對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pSE380-amy進(jìn)行雙酶切，由于amy基因處有BamHI位點(diǎn)，用BamHI、HindIII雙酶切必將切下約1.3 kb左右的amy基因片段和4.3 kb片段，如圖1（B）所示，表明amy基因與pSE380表達(dá)載體連接成功。

圖1 amy PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析及重組質(zhì)粒pSE380-amy酶切驗(yàn)證Fig.1 Garose gel electrophoresis analysis of PCR and Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmids pSE380-amy digested with BamHI and HindIII

2.2 Geobacillus sp.GXS1的α-淀粉酶基因的同源性分析

將酶切驗(yàn)證正確后的重組質(zhì)粒pSE-amy測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank，Geobacillus sp.GXS1的α-淀粉酶核苷酸序列GenBank登錄號(hào)為FJ481119，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)Geobacillus sp.GXS1的α-淀粉酶基因序列和已報(bào)道的alpha-amylase基因的DNA序列有很高的同源性，其中與G.sp.Y412MC52（ 登 錄 號(hào) ：ACNM01000012）、Geobacillus kaustophilus HTA426（登錄號(hào)：BA000043）、Geobacillus sp.POT5（登錄號(hào)：EF080863）、GeobacillusthermodenitrificansNG80-2（登錄號(hào)：CP000557）的alpha-amylase基因氨基酸序列的相似性分別為95.5%、94%、89%和84%，而DNA序列上相似性分別為96.5%、96%、93%和90%。應(yīng)用Mega4.0、ClustalW等軟件對(duì)GXS1株菌的alpha-amylase基因的氨基酸進(jìn)行同源性比對(duì)分析、系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2。

圖2 GXS1菌株α-淀粉酶系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of alpha-amylase from strain GXS1

從圖2可以看出，GXS1的α-淀粉酶與G.sp.Y412MC52（ACNM01000012）的 α-淀粉酶基因親緣關(guān)系最密切。

2.3 α-淀粉酶基因的表達(dá)及純化

將含有重組質(zhì)粒pSE-amy的菌株pAMY培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)及鎳柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3。

從圖3中可以看出，重組菌與對(duì)照菌相比在58 ku處出現(xiàn)特征蛋白帶，與核酸序列理論推算的蛋白質(zhì)分子量相符，表明amy基因已在大腸桿菌中成功地表達(dá)，并且酶的純度已經(jīng)可以進(jìn)行下一步的酶學(xué)特性的研究。

2.4 重組α-淀粉酶基因的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)α-淀粉酶活力的影響

在不同溫度下（30℃～100℃）反應(yīng)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法[11]測(cè)定酶活，以酶活最高者為100%，結(jié)果見圖4。

圖3 純化后的重組α-淀粉酶的SDS–PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE protein of purified alpha-amylase and the gel stained for alpha-amylase activity

圖4 溫度對(duì)Geobacillus.sp.GXS1α-淀粉酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of GXS1 alphaamylase

從圖4可以看出，在30℃～65℃之間，酶活隨著溫度的升高而增強(qiáng)，而在65℃～100℃之間，酶活隨著溫度的升高而降低，結(jié)果顯示重組α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為65℃。

2.4.2 pH對(duì)α-淀粉酶活力及穩(wěn)定性的影響

在最適溫度下，不同pH條件下下反應(yīng)，按標(biāo)準(zhǔn)方法[11]測(cè)酶活力，以酶活最高者為100%結(jié)果見圖5。

圖5 pH對(duì)酶活力及其穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of GXS1 alphaamylase

將酶放置在不同pH條件下，30℃保溫2 h后，以未處理的原酶液活力為100%，測(cè)定殘余酶活力，作pH穩(wěn)定性曲線。圖5所示重組的α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH為7.0，該酶在pH5.0-10.0之間活性相對(duì)穩(wěn)定，在pH10.0下保溫2 h后殘余酶活力為74%。

2.4.3 米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速度（Vmax）測(cè)定

以可溶性淀粉為底物，在不同底物濃度下測(cè)定酶活，用Linewear-Burk作圖法求出該酶對(duì)底物的Km值，見圖6。結(jié)果表明大腸桿菌重組子表達(dá)的α-淀粉酶的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為2.79 mg/mL，Vmax為32.5 μmol/mL·min。

圖6 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定α-淀粉酶對(duì)可溶性淀粉的Km值Fig.6 Lineweaver-Burk plot used for determination of the Km values for alpha-amylase on soluble-starch substrate

2.4.4 EDTA對(duì)酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)以1 mmol/L～10 mmol/L不同濃度的EDTA加入到酶與底物的反應(yīng)體系中，結(jié)果如圖7所示。

圖7 EDTA對(duì)α-淀粉酶酶活的影響Fig.7 Effect of EDTA on the enzyme activity of alpha-amylase

EDTA對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用隨著濃度的增加而加強(qiáng)。

2.4.5 其他化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

在反應(yīng)體系中加入不同濃度金屬離子，使其終濃度2.0 mmol/L，50℃保溫0.5 h后，放置冰上迅速冷卻至室溫，按標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)殘余酶相對(duì)活力，以不含金屬離子的酶液為對(duì)照（表1）。從表1結(jié)果可以看出，金屬離子 Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Co2+、Hg2+、Ag+對(duì)酶活有顯著抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最大，Mn2+、Ba2+對(duì)酶活有微弱的抑制作用，K+、Ca2+、Mg2+、巰基乙醇對(duì)酶活有微弱的激活作用，而其他一些離子如Na+、Li+則對(duì)酶活影響不大。

表1 化學(xué)試劑對(duì)α-淀粉酶活力的影響Table 1 Effects of chemical reagents on α-amylase activity

2.4.6 重組α-淀粉酶水解特性的研究

在1 mL含有10 g/L底物（可溶性淀粉）的磷酸緩鈉沖液（pH7.0）中加入純化酶，65 ℃分別水浴 1、3、6、12、24 h后，以10 g/L的麥芽糖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣作為對(duì)照，用HPLC檢測(cè)其反應(yīng)產(chǎn)物。通過高效液相我們可清楚的發(fā)現(xiàn)反應(yīng)6 h，此α-淀粉酶能把1%的可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為5.3 g/L的麥芽糖，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄糖的比例在增加，而麥芽糖與麥芽三糖的比例在下降。本研究重組α-淀粉酶不同時(shí)間水解淀粉產(chǎn)物中各組分所占比例如表2。

表2 不同時(shí)間α-淀粉酶水解可溶性淀粉產(chǎn)物的濃度比Table 2 The concentration of reaction products by alpha-amylase hydrolysis soluble starch at different times

3 討論

本文克隆了Geobacillus sp.GXS1的α-淀粉酶基因，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，為今后對(duì)α-淀粉酶基因進(jìn)行改造以期獲得高活力的突變酶以及進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)α-淀粉酶提供參考。但仍然存在問題：重組α-淀粉酶表達(dá)需在低溫誘導(dǎo)（20℃），才能有效防止包涵體的生成，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；含有信號(hào)肽的Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的分泌效率低；重組的α-淀粉酶基因作用于淀粉轉(zhuǎn)化麥芽糖的效率不是很高。

本課題組下一步將利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)同源建模以及計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)，對(duì)Geobacullus sp.GXS1的α-淀粉酶基因進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)改造來提高酶學(xué)性質(zhì)。

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