高美玲，徐麗美，李 鈁，楊 豐＊

（1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門361102；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

對(duì)蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起對(duì)蝦爆發(fā)流行病的病原體［1］，該病發(fā)病快、傳播速度快、致病能力強(qiáng).感染該病毒的養(yǎng)殖場(chǎng)3～10d內(nèi)達(dá)到100%死亡率［1－4］，給蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前已成為蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中危害最大的病原.WSSV是線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus）的唯一成員.病毒粒子形態(tài)呈桿狀型，大小約（250～380）nm×（70～150）nm，最外層是由2層單位膜組成的囊膜，緊接囊膜向內(nèi)的是核衣殼.該病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，大小約300kb，目前共測(cè)序完成3株病毒的全基因組序列［5－7］.

在WSSV基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)WSSV病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析鑒定，共鑒定42個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白［8－9］.經(jīng)鑒定蛋白VP95不僅存在于膜蛋白，核衣殼蛋白中也有它的分布［8］，Tsai等［10］提出病毒粒子除了有核衣殼和囊膜外，在核衣殼和囊膜之間還有第3種結(jié)構(gòu)稱為外被（tegument），因此一些蛋白就被歸類為外被蛋白，其中就包括蛋白VP95.這些研究結(jié)果表明，VP95是一種很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，可能對(duì)于病毒的包裝起著極其重要的作用.為了深入研究蛋白VP95的功能，以及它在病毒粒子中的定位，本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法確定基因vp95的轉(zhuǎn)錄時(shí)間，確定其為晚期基因.其次嘗試制備能夠用于VP95蛋白檢測(cè)，蛋白質(zhì)定位等研究的專一性抗體，為該結(jié)構(gòu)蛋白后續(xù)研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)所用淡水克氏原螯蝦（Procambarus clakia）購(gòu)于廈門市第八市場(chǎng)；TRL REAGENT為Mrcgene公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Roch公司產(chǎn)品；菌株大腸桿菌（Escherichiacoli）XL1－Blue和BL－21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMD18－T Vector、T4 DNA ligase、限 制 性 內(nèi) 切 酶、RNase－free DNase I、RNase inhibitor、Oligo（dT）引物均為TaKaRa公司產(chǎn)品；pET－His購(gòu)于美國(guó)基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室有限公司；Ni2＋－NTA agaros購(gòu)于Qiagen公司；20×TBST緩沖液購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；HiTrap NHS－activated HP親和層析純化柱子為GE Healthcare公司產(chǎn)品；抗生素氨芐青霉素為山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母膏、瓊脂為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；小量提取質(zhì)粒試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；引物合成由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成；測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成；多克隆抗體由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳福課題組制備；鼠抗組氨酸IgG購(gòu)自SIGMA公司；堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG購(gòu)自Promega公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 方 法

1.2.1 WSSV病毒粒子的純化及基因組的提取

WSSV病毒粒子的純化和基因組的提取參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的方法［5，11］.取100μL純化的病毒粒子懸液，加入終質(zhì)量濃度0.05mg／mL的 Triton X－100，10 000g離心10min，得到的沉淀樣品為病毒核衣殼蛋白（nucleocapsid protein），上清樣品為病毒囊膜蛋白（envelope protein）.

1.2.2 RT－PCR

克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV后（肌肉注射108病毒粒子／只），不同時(shí)間點(diǎn)取樣（0，2，4，6，8，12h）.步足肌肉總RNA的提取參照TRL REAGENT試劑盒說(shuō)明，隨后用逆轉(zhuǎn)錄酶以及Oligo（dT）引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA作為模板，分別用ie1、vp28、vp95或β－actin的特異性引物對(duì)（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外成像儀觀察結(jié)果.

表1 RT－PCR分析引物序列Tab.1 Primer sets used for RT－PCR analysis

1.2.3vp95基因片段的克隆

基因vp95位于WSSV基因組中255 075～257 474nt，對(duì)應(yīng)的ORF為 WSV442.經(jīng)過(guò)生物學(xué)軟件DNAstar分析該基因所編碼蛋白的抗原性，選擇其中間200個(gè)氨基酸進(jìn)行克隆表達(dá)，分布在vp95基因的1 051～1 650nt.引物序列：5′－AGCggatccGAGCATCCTCTATCCCCTTCTATT－3′ （下 劃 線 為BamH I 酶 切 位 點(diǎn) ），5′－AGCaagcttTTCCAGTCTGACGACCCTGAC－3′（下劃 線為HindIII酶切位點(diǎn)）；以純化的 WSSV基因組作為模板，PCR程序如下：95℃變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切反應(yīng)后，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，然后將其連接至帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pET－His，并測(cè)序驗(yàn)證.

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)純化

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET－His－VP95－M200轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL－21（DE3），同時(shí)轉(zhuǎn)化pET－His作為對(duì)照組.挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接至5mL含有100μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6h后，按照1∶200轉(zhuǎn)接于200mL LB培養(yǎng)基（含100μg／mL氨芐青霉素）.培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期（OD600值達(dá)到0.6）時(shí)，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.1mmol／L，20℃誘導(dǎo)表達(dá)24h.誘導(dǎo)前后分別取適量菌液進(jìn)行SDS－PAGE分析.收集誘導(dǎo)后的大腸桿菌細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞后，用特異性結(jié)合His標(biāo)簽的Ni2＋－NTA agaros純化表達(dá)的重組蛋白.

1.2.5 多克隆抗體的制備及純化

用純化的重組蛋白His－VP95－M200免疫小鼠，免疫4周后眼球取血，去除血細(xì)胞得到血清.抗體純化根據(jù)HiTrap NHS－activated HP純化柱試劑盒的操作說(shuō)明.首先，經(jīng) Ni2＋－NTA agaros純化的抗原 His－VP95－M200 用 Coupling buffer （0.2mol／L NaHCO3，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）稀釋至終質(zhì)量濃度1mg／mL，將抗原溶液注入HiTrap柱子，4℃吸附4h.分別用18mL Buffer A （0.5mol／L氨基乙醇，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）和 18mL Buffer B（0.1 mol／L乙酸鈉，0.5mol／L NaCl，pH 4）洗滌.然后，用Binding buffer（0.5mol／L NaCl，10mmol／L Tris－HCl4，pH 7.5）稀釋多抗血清，經(jīng)0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾后與抗原柱結(jié)合，再用5～10倍柱子體積的Binding buffer洗滌.最后，用2倍體積 Elution buffer（0.1 mol／L 甘氨酸，pH 2.5）洗脫，洗脫液立即用1mol／LTris－HCl pH 8.0調(diào)節(jié)pH至中性.

1.2.6 SDS－PAGE和 Western blot分析

重組表達(dá)的蛋白樣品和病毒組分的蛋白樣品按4∶1比例加入5×SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸10 min，冷卻至室溫后進(jìn)行SDS－PAGE分離，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，觀察分析結(jié)果.

對(duì)于Western blot分析，SDS－PAGE后不進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在含有5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂奶粉的TBST中室溫封閉1h，加入抗目標(biāo)蛋白的鼠抗抗體（1∶5 000稀釋）或者制備的抗血清，室溫溫育1h.在TBST漂洗3次后，PVDF膜與稀釋在封閉液中的堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（1∶10 000）溫育1h，TBST漂洗3次，在NBT／BCIP顯色液中.待出現(xiàn)清晰條帶后，將膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中終止反應(yīng)即可.

2 結(jié) 果

2.1 基因vp95的表達(dá)時(shí)序分析

通過(guò)收集克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間的腹足樣品，用RT－PCR分析vp95的轉(zhuǎn)錄時(shí)間，同時(shí)還檢測(cè)了已經(jīng)被鑒定的極早期基因ie1［12］和晚期基因vp28.結(jié)果表明（圖1），從4h開(kāi)始vp95開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，6 h轉(zhuǎn)錄水平有些增加，直到12h一直維持在這個(gè)水平.極早期基因ie1在2h就開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并且之后一直保持同一轉(zhuǎn)錄水平.而vp28也是從4h開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，6h后轉(zhuǎn)錄有所增加.基因vp28和vp95都編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，且起始轉(zhuǎn)錄時(shí)間相同.因此，vp95也是一個(gè)晚期基因.

2.2 重組蛋白的克隆表達(dá)及純化

通過(guò)DNAstar軟件分析vp95基因所編碼的蛋白，截取vp95基因中間編碼200氨基酸的序列（1 051～1 650nt），該氨基酸片段親水性強(qiáng)，不含有α螺旋，抗原性較好.以WSSV基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到600bp的片段，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1.2%的瓊脂糖電泳分離，與預(yù)測(cè)600bp大小一致（圖2）.此片段依次克隆到pMD18－T Vector和pET－His載體中，經(jīng)雙酶切鑒定（圖2）后測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建質(zhì)粒pETHis－VP95－M200.

將質(zhì)粒 pET－His－VP95－M200轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主BL－21，加入IPTG 20 ℃ 誘 導(dǎo)表達(dá) 重組蛋白.SDSPAGE分析顯示，加入IPTG誘導(dǎo)后約在32ku的位置有明顯的融合蛋白表達(dá)帶（圖3，泳道2），而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌對(duì)應(yīng)位置的樣品無(wú)明顯條帶（圖3，泳道1）.誘導(dǎo)后的細(xì)菌經(jīng)超聲波破裂后離心，用Ni2＋－NTA agaros純化，獲得純化的 His－VP95－M200融合蛋白（圖3，泳道3）.Western blot檢測(cè)得到的是帶有His標(biāo)簽的融合蛋白（圖3，泳道4）.

圖1 RT－PCR對(duì)vp95的表達(dá)時(shí)序分析Fig.1 Time course analysis of vp95 transcripts by RT－PCR

2.3 抗體的特異性分析

將WSSV的EP、NP和全病毒粒子（virion，V）樣品經(jīng)10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS－PAGE電泳分離（圖4（a）），考馬斯亮藍(lán)染色后出現(xiàn)許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白的條帶.為了測(cè)定制備的VP95抗體的專一性，將抗血清稀釋不同濃度，以囊膜蛋白、核衣殼蛋白和全病毒粒子樣品為底物，Western blot檢測(cè)蛋白 VP95（圖4（b）），發(fā)現(xiàn)僅VP95能呈現(xiàn)清晰條帶，說(shuō)明制備的VP95抗體特異性強(qiáng).同時(shí)，制備感染了WSSV的克氏螯蝦的造血組織（hematopoietic tissue，HT）的樣品，用制備的抗體作為一抗，檢測(cè)其中的蛋白VP95.結(jié)果顯示抗體可以專一性的檢測(cè)到組織中的VP95蛋白（圖4（b））.

3 討 論

對(duì)于雙鏈DNA病毒而言，其基因組的表達(dá)呈時(shí)序性，可分為極早期（immediately early）、早期（early）、晚期（late）基因.WSSV基因的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)在對(duì)蝦和淡水螯蝦中有廣泛的研究，許多基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序已經(jīng)被確定，包括極早期基因19個(gè)（ie1、ie2、ie3［12］、wsv051、wsv083、wsv249［13］等），早期基因 5個(gè)（rr1、rr2、pk1、tk－tmk、dnapol）［4－17］，晚期基因6 個(gè)（vp664、vp28、vp26、vp24、vp19、vp15）［18］.本研究通過(guò)高劑量WSSV（每只含108個(gè)病毒數(shù)）感染克氏原螯蝦，提取總RNA進(jìn)行RT－PCR，發(fā)現(xiàn)在2h時(shí)極早期基因ie1開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，而在4h時(shí)vp95基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，與vp28基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的時(shí)間相同，說(shuō)明vp95也是一個(gè)晚期基因.

圖2 VP95－M200PCR產(chǎn)物（a）、重組質(zhì)粒pMD18－T－VP95－M200（b）和pET－His－VP95－M200雙酶切（c）鑒定電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of the PCR products of VP95－M200（a），identification of recombinant plasmid pMD18－T－VP95－M200（b）and pET－His－VP95－M200（c）by restriction analysis

圖3 重組蛋白的 His－VP95－M200 12%SDS－PAGE電泳及Western blot分析Fig.3 12%SDS－PAGE and Western blot analysis of the expressed product of His－VP95－M200

圖4 抗體對(duì)VP95的檢測(cè)分析Fig.4 Analysis of VP95using the prepared antiserum

結(jié)構(gòu)蛋白VP95是WSSV的重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，為了研究它的定位及其在病毒包裝過(guò)程中的作用，曾經(jīng)多次嘗試克隆多個(gè)不同位置，不同片段大小的多肽，均為不溶性表達(dá)，免疫小鼠得到的多抗對(duì)于蛋白VP95的檢測(cè)效果并不好，無(wú)法滿足對(duì)自然狀態(tài)下VP95蛋白的免疫金標(biāo)定位實(shí)驗(yàn)，及其他該蛋白功能研究的要求.本研究首先通過(guò)生物學(xué)軟件對(duì)該蛋白的性質(zhì)進(jìn)行分析，選擇vp95基因的1 051～1 650nt，主要是由于這段序列編碼的多肽的親水性氨基酸較多，容易得到可溶性的表達(dá).為獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，嘗試不同程度的低溫誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)16和20℃均為可溶性表達(dá)，最終選用20℃作為誘導(dǎo)條件.選用pET－His載體本身包含編碼6個(gè)His的序列，能表達(dá)出含有His融合標(biāo)簽的重組蛋白，有利于后期的純化.介質(zhì)Ni2＋－NTA agaros可用于純化帶有His融合標(biāo)簽的重組蛋白，該介質(zhì)價(jià)格低廉，純化效率高，通過(guò)調(diào)整吸附液和洗滌液中咪唑的濃度，可以得到較純的重組蛋白.提高吸附液中咪唑的濃度可以減少對(duì)大腸桿菌中蛋白的非特異性吸附，但太高濃度也可能導(dǎo)致重組蛋白結(jié)合效率降低.利用該介質(zhì)獲得了高純度和高濃度的重組蛋白.

將純化的融合蛋白免疫小鼠，得到多抗血清.經(jīng)Western blot檢測(cè)，此血清對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP95有很高的效價(jià)，并且有很強(qiáng)的專一性，能滿足多種實(shí)驗(yàn)需求，如 Western bloting、免疫熒光、免疫金標(biāo)等.同時(shí)，Western blot也可以檢測(cè)出感染了WSSV的組織中的VP95.但是，多抗血清中不僅含有針對(duì)抗原的抗體，同時(shí)還含有很多其他的抗體和酶類等.因此，選擇HiTrap NHS－activated HP （GE Healthcare）親和純化柱子純化多抗血清.該純化柱首先與抗原非特異性的結(jié)合，并將抗原固定在柱子上，再將血清與結(jié)合了抗原的柱子孵育，讓血清中針對(duì)該抗原的抗體與抗原結(jié)合.通過(guò)洗滌，將結(jié)合的抗體及雜質(zhì)去除，最后，用洗脫緩沖液將抗體從柱子上洗脫下來(lái)，得到較純的針對(duì)VP95蛋白的抗體.經(jīng)Western blot檢測(cè)，仍然有較高的效價(jià)，而且去除雜質(zhì)的血清可以用于免疫金標(biāo)和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究VP95蛋白的功能，及其在病毒粒子的定位提供了很好的條件.

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