張麗艷，牛素芳，張 曼，王 軍＊

（1.廈門大學海洋與地球學院 福建 廈門361102；2.福建海洋研究所 福建 廈門361012）

竹莢魚（TrachurusjaponicusTemminck et Schlegel）隸屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹莢魚屬（Trachurus），為暖溫性中上層洄游性魚類，主要分布于西北太平洋的中國、日本和朝鮮半島沿海，是福建沿海的常見經濟魚類［1］.

福建沿海竹莢魚的主要作業(yè)漁場為閩中—閩東漁場和閩南—臺灣淺灘漁場.盧振彬等［2－3］通過對這兩個漁場不同生態(tài)類群漁業(yè)資源生產量的研究發(fā)現，兩漁場主要經濟底層和近底層魚類實際年漁獲量均連續(xù)數年超過其最大可持續(xù)開發(fā)量，呈過度捕撈狀態(tài)，資源嚴重衰退，而中上層魚類資源已日漸取代底層和近底層魚類，成為兩漁場的重要開發(fā)對象.20世紀末，竹莢魚資源在閩南—臺灣淺灘漁場較為穩(wěn)定，但在閩東漁場已出現衰退現象［4］.21世紀初，宋普慶等［5］在對臺灣海峽游泳動物調查時，發(fā)現該海域游泳動物資源衰退明顯，其中就包括竹莢魚.在這種情況下，急需開展竹莢魚野生資源現狀評估及群體遺傳特性研究，以便為科學合理的管理和利用竹莢魚野生資源提供依據.目前，有學者依據竹莢魚的形態(tài)特征、性成熟和洄游分布狀況將東海竹莢魚劃分為不同的群體［6－9］，而臺灣海峽不同漁場之間的水文特征不同，可能導致竹莢魚群體在遺傳學上產生分化，本研究將從遺傳學的角度對其進行判斷.

擴增片斷長度多態(tài)性（AFLP）技術是中性選擇的DNA分子遺傳標記技術，具有用量少、檢測遺傳變異靈敏、擴增效率高、多態(tài)性強等優(yōu)點.近年以來該技術已經被廣泛應用于海洋魚類的群體遺傳多樣性研究［10－13］、仔稚魚鑒定［14］、對野生和養(yǎng)殖群體的種質資源評估［15］、系統(tǒng)發(fā)育關系研究［16］等諸多領域.本研究運用AFLP技術對閩東漁場和閩南漁場的2個竹莢魚群體進行遺傳多樣性分析，研究結果將從遺傳學上揭示臺灣海峽竹莢魚的群體劃分，同時也為臺灣海峽竹莢魚遺傳資源現狀的準確評價與合理開發(fā)利用提供理論指導和技術支持.

1 材料與方法

1.1 材 料

于2009年3—4月，采集福建省寧德霞浦近海和廈門近海2個竹莢魚群體（閩東群體和閩南群體）樣品，樣品運回實驗室進行形態(tài)學鑒定和測量，其中體長分別為168.6～246.3mm、178.2～251.0mm，叉長范圍分別為176.4～220.8mm、196.1～246.4mm.閩東、閩南群體各隨機挑選30尾，取背部肌肉保存于95%（體積分數）乙醇中.

1.2 基因組DNA提取和AFLP圖譜構建

采用酚－三氯甲烷方法提取基因組DNA，將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100μL蒸餾水中，4℃保存?zhèn)溆?參照Vos等［17］的方法構建AFLP圖譜.利用內切酶EcoR I和MseI進行雙酶切；然后與EcoR I接頭和MseI接頭進行接頭；預擴增引物的3′末端加1個選擇性堿基，其序列分別為EcoR I＋A（5′－GACTGCGTACCAATTC＋A 3′）和MseI＋C （5′－GATGAGTCCTGAGTAA＋C 3′）；將預擴產物進行10倍稀釋用于選擇性擴增，選擇性擴增引物的3′末端加3個選擇性堿基（表1）.將PCR擴增產物在6%（質量分數）的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行60W恒功率高壓電泳.電泳結束后，用10%（質量分數）乙酸固定、銀染和顯影.選取擴增條帶清晰、多態(tài)性高的8對引物組合：E1／M5、E1／M1、E5／M3、E2／M2、E5／M5、E1／M2、E1／M4、E2／M3進行AFLP數據統(tǒng)計分析.

1.3 數據統(tǒng)計分析

AFLP為顯性標記，對電泳圖譜中同一位置上清晰的AFLP條帶進行統(tǒng)計，有條帶記為1，視為顯性表型，無條帶記為0，視為隱形表型，得出0和1原始數據矩陣.利用POPGENE 1.31軟件統(tǒng)計位點總數、多態(tài)位點數和每個引物組合的多態(tài)位點比例，計算顯性基因型頻率、Shannon多樣性指數、Nei遺傳多樣性指數、遺傳分化系數（Gst）、遺傳相似性指數和遺傳距離；利用SPSS 13.0中的t檢驗對Nei遺傳多樣性指數和Shannon多樣性指數進行差異顯著性檢驗；利用Phyltools 1.32軟件計算獲得個體間遺傳距離矩陣，利用軟件MEGA 5.0構建基于個體間遺傳距離的NJ聚類樹；利用 Arlequin 3.1進行分子生物學方差分析（AMOVA）和位點差異數分析.遺傳學參數計算主要參考文獻［13］.

2 結 果

利用8對選擇性引物，在60尾竹莢魚中共擴增出433條清晰的條帶（100～1 000bp，不清晰的條帶不納入統(tǒng)計）.其中，多態(tài)性條帶為286條，多態(tài)位點比例為66.05%.每個引物組合產生的擴增條帶數范圍為40～69條，擴增出的多態(tài)性條帶范圍為24～54條，多態(tài)檢出率范圍為60.00%～78.26%（表2）.

表1 選擇性擴增引物Tab.1 Selective amplification primers and their sequences used in AFLP analysis

表2 各引物組合的擴增結果Tab.2 Number of bands generated by primer combinations

8對選擇性引物在閩東和閩南2個群體的433條條帶中，并未發(fā)現群體間的特異性條帶.閩東和閩南群體平均多態(tài)位點比例分別為63.28%和61.89%，Nei遺傳多樣性指數分別為0.171 8和0.172 2，Shannon多樣性指數分別為0.267 3和0.267 3（表2、表3）.綜合比較所有遺傳多樣性參數可以發(fā)現，閩東和閩南2個竹莢魚群體的遺傳多樣性水平基本一致，兩者之間的差異并不顯著（Nei遺傳多樣性指數和Shannon多樣性指數的p值分別為0.880和0.938）.

表3 竹莢魚2個群體的遺傳學參數Tab.3 Parameters of genetic diversity for two populations of T.japonicus

2個群體間擴增位點遺傳相似性指數和遺傳距離分別為0.984 2和0.015 9；根據Gst、AMOVA 分析估算的竹莢魚2個群體的遺傳變異分別有95.57%、93.99%存在于群體內，4.43%、6.01%存在于群體間（表4）；2個群體間Nm高達10.796 9（表3）.分析表明，竹莢魚2個群體間未發(fā)現顯著的遺傳結構，不存在明顯遺傳分化.

表4 竹莢魚遺傳結構的AMOVA分析Tab.4 Analysis of molecular variance（AMOVA）of genetic structure for T.japonicus

將433條擴增條帶的顯性基因型頻率以10%為單位劃分區(qū)間，0和1分別設為一個單獨的區(qū)間，統(tǒng)計顯性基因型頻率位于各區(qū)間內的位點數（圖1）.結果顯示，在1%～9%、80%～89%和關鍵點1的基因型頻率呈現峰值，2個群體的顯性基因型頻率分布基本一致，說明2個群體的遺傳結構相似.利用Arlequin軟件統(tǒng)計個體間位點差異數頻率分布（mismatch distribution），單個群體和所有個體位點差異數分布見圖2.圖中2個群體位點差異數分布圖都呈單峰型，峰值差異位點數雖有所偏移但相差很小，說明個體間遺傳距離頻率分布基本相同，2個群體遺傳結構非常相近.

圖2 竹莢魚AFLP數據觀測位點差異數分布圖Fig.2 The observed pairwise differences of the AFLP data of T.japonicas

為進一步分析2個竹莢魚群體間遺傳分化程度，利用MEGA 5.0軟件對60尾竹莢魚個體構建NJ系統(tǒng)樹（圖3）.系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構較簡單，未檢測到與采樣地點相對應的分支，不存在明顯的譜系結構，同樣說明2個群體間的遺傳分化不明顯.

圖1 擴增位點數在不同顯性基因頻率區(qū)間內的分布Fig.1 Distributions of amplified loci in different frequency intervals

圖3 竹莢魚60個個體的NJ聚類樹Fig.3 NJ tree of 60individuals of T.japonicas

3 討 論

3.1 群體遺傳多樣性水平

物種的遺傳多樣性是其進化潛能的保證，是生存、發(fā)展和進化的前提，同樣也是形成生物多樣性的基礎.物種遺傳多樣性愈高，其適應周圍環(huán)境的能力愈強；反之，則易受到環(huán)境變化的影響，尤其是過度捕撈等人為因素造成的物種遺傳多樣性的降低更應引起重視.本研究利用8對引物對福建沿海竹莢魚資源的遺傳多樣性進行了AFLP分析，結果呈現出豐富的多態(tài)性和較高的靈敏度，表明AFLP技術適用于竹莢魚的群體遺傳學分析.

比較2個竹莢魚群體的多態(tài)位點比例、Nei遺傳多樣性指數和Shannon多樣性指數，閩東和閩南群體的遺傳多樣性水平基本一致，兩者之間并無差異顯著，都具有較高的遺傳多樣性.比較以往魚類AFLP研究結果發(fā)現，福建近海竹莢魚的多態(tài)位點比例（61.89%～63.28%）明顯高于我國沿海多種經濟魚類（表5）；與同海域的藍圓鲹（Decapterusmaruadsi）（58.97%～62.70%）［13］相近.可見，福建近海竹莢魚群體的多樣性仍處于較高水平，具有較高的進化潛力.

表5 我國沿海經濟魚類AFLP多態(tài)位點比例比較Tab.5 Comparison of percentage of AFLP polymorphism of economic fishes in China′s coastal waters

福建近海竹莢魚資源仍保持相當豐富的遺傳變異水平的原因是：1）竹莢魚生境范圍較廣，使其面臨的自然選擇壓力相對較小，可以積累較多的遺傳變異；2）Frankhan［23］認為動物遺傳多樣性與個體大小呈負相關，個體越小繁殖周期越短則遺傳變異越大.竹莢魚成魚體長一般為200～250mm［1］，性成熟年齡為Ⅰ齡，年齡結構為0～Ⅳ齡［7］.具有生命周期短，生長速度快，性成熟早，生殖魚群中補充群體數量大于剩余群體的特點［6］，可影響其有效群體的數量，使遺傳多樣性偏高；3）第四紀以來的全球性溫度大幅度升降導致了物種遺傳多樣性的丟失，處于物種分布區(qū)南北兩邊緣的群體遺傳多樣性損失最高［24］.竹莢魚的分布范圍從中國南?？缍鹊饺毡竞Ｓ?，福建近海處于其分布海域的中部位置，這使得該海域竹莢魚在冰期氣候波動中受到的影響相對較小，保留了較高的遺傳多樣性.

3.2 群體遺傳分化分析

AMOVA分析和NJ聚類樹均未檢測到相對應的地理分支或者地理群，且Gst值偏小.這些結果都表明福建近海的竹莢魚群體間遺傳分化較小，遺傳變異主要存在于群體內，群體間無明顯的遺傳分化.位點差異數分布和顯性基因頻率分布圖顯示，2個群體遺傳結構相似，沒有形成各自獨立的遺傳結構.已有研究結果表明，許多海洋魚類如日本鳀（Engraulisjaponicus）［25］、帶魚（Trichiurushaumela）［26］、銀鯧［12］、藍圓鲹［13］等在東海海域的連續(xù)分布區(qū)內都不存在顯著遺傳差異.在更新世冰期，作為西太平洋幾個廣闊的大陸架之一，東海陸架約有85萬hm2的面積因為海平面的下降變?yōu)殛懙兀?0］.末次冰期后，伴隨海平面上升，該海域 的 白 姑 魚 （Nibeaalbiflora）［11］、梭 魚 （Chelon haematocheilus）［27］等由其避難所發(fā)生重新殖化事件，之后又發(fā)生近期擴張重新進入東海大陸架.福建近海竹莢魚棲息地擴張發(fā)生的時間比較晚，群體由于缺乏足夠的時間在遷移和漂變之間取得平衡而造成這些物種群體間均無明顯遺傳分化.這也是福建近海竹莢魚遺傳同質性高的一個原因.Song等［9］利用線粒體控制區(qū)基因片段對中日沿海9個群體的竹莢魚研究發(fā)現，竹莢魚群體可能經歷過近期群體擴張事件，群體間無明顯遺傳分化，與本研究結果相同.

環(huán)境動力和擴散特征也通常被認為是決定群體結構的重要因素之一.海洋大環(huán)境中不存在明顯的有效地理隔離，且洋流對海洋生物卵、幼體和成魚具有較強的輸送作用，這些因素使得群體間分化程度很低，不存在顯著的遺傳結構［28］.竹莢魚產卵期為11月至翌年4月［6］，屬浮性卵，受精卵在水溫20～22℃時，約50h孵出仔魚［1］.此外，竹莢魚具有明顯的季節(jié)洄游，其產卵場和越冬場在東海中南部，而索餌場在東海中北部和黃海部分海域［1］.這些生活史特征表明竹莢魚的卵、幼魚和成魚具有較強的擴散能力.而福建近海交匯的黑潮、臺灣暖流和臺灣海峽北上海流則有利于該海域生物卵和幼體的擴散.在夏季，有部分閩南—臺灣淺灘漁場的竹莢魚幼魚階段魚群到達閩中、閩東沿海［6］，成為閩東漁場竹莢魚的補充群體，這可能就是借助臺灣暖流和臺灣海峽北上海流完成的.群體間Nm用來表示群體間的基因交流程度，當Nm＞4，則表明群體間是一隨機交配的群體［29］.本研究的2個竹莢魚群體間基因流明顯大于4（10.796 9），表明閩東、閩南群體間基因交流頻繁，不存在交配障礙.據此認為，竹莢魚較強的擴散能力和福建近海的洋流也可能造成福建近海竹莢魚缺乏系統(tǒng)地理結構.

在漁業(yè)管理應用中應持謹慎態(tài)度.雖然本研究結果從遺傳學角度上表明竹莢魚仍具有較高的遺傳多樣性，但過度捕撈可能會造成竹莢魚的低齡化，在幼魚被大量的捕撈的情況下，整個竹莢魚的資源量長時間得不到持續(xù)有效的補充，最終可能會導致資源的進一步衰退.

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