李娜，劉群，李曉娟，白曉暉，劉玥蕓，金鐘曄，景玉霞，2，趙宏波，3，陳家旭

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029;2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054;3.北京市石景山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 100043)

糖尿病并發(fā)抑郁癥是在糖尿病的基礎(chǔ)上出現(xiàn)抑郁癥狀，糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝紊亂，持續(xù)高血糖并伴情緒障礙，以心境低落為主，嚴(yán)重者有自殺傾向［1］。轉(zhuǎn)引自世界衛(wèi)生組織1993年以來開展全球疾病負(fù)擔(dān)研究發(fā)現(xiàn)的一段資料表明，糖尿病患者的抑郁癥患病率為21.8% ～60.8%［2］，并有國外資料報(bào)道，糖尿病患者抑郁癥患病率至少是普通人群的3倍，其中中重度抑郁占1/3［3］。現(xiàn)今生理-心理-社會醫(yī)學(xué)模式已被廣大醫(yī)學(xué)工作者所接受，但糖尿病合并抑郁癥的具體作用機(jī)制眾說紛紜。用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)糖尿病模型已有 50 年的歷史［4］［5］，本課題組采用的21 d慢性束縛建立抑郁癥模型也有良好穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［6］。因此本課題組采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量STZ的方法制備2型糖尿病模型，并在其基礎(chǔ)上再用21 d慢性束縛應(yīng)激抑郁的方法建立糖尿病兼抑郁癥大鼠模型。并從大鼠的宏觀表征、空腹血糖、體重、曠場實(shí)驗(yàn)行為學(xué)角度評價(jià)此模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Wistar大鼠38只，雄性，4周齡，體重(170±20)g。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(京)2011-0024】。

1.1.2 儀器

STZ:Sigma公司(美國)。一水合檸檬酸:西隴化工股份有限公司(中國)。二水合檸檬酸三鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國)。強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀及配套試紙(美國)。大鼠束縛架:自制，木質(zhì)結(jié)構(gòu)，上面兩側(cè)分別有兩條可以調(diào)節(jié)的粘貼軟帶，分別用來束縛大鼠的胸部和腹部(中國)。大鼠曠場行為測試箱:自制，木質(zhì)(長×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm)，底面由黃色線條劃分成面積相等的25個(gè)方格(中國)。計(jì)算機(jī) WV-CP470攝像頭(Panasonic)(日本)。The Observer.5.0分析軟件(Noldus，Netherlands)，EthoVision 3.0 分析軟件(Noldus，Netherlands)進(jìn)行分析(荷蘭)。

1.1.3 飼料

基礎(chǔ)飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供;高脂飼料購自北京華阜康公司(配方:68.8%基礎(chǔ)飼料、10%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

38只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為兩組，其中8只為正常組，飼以普通飼料，其余30只大鼠飼以高脂飼料。所有大鼠均由SPF級飼養(yǎng)，每天12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。6周后，夜間禁食14 h后，高脂飼料組腹腔注射STZ(35 mg/kg溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.4)于3 d后及7 d后測空腹血糖，測得兩次血糖值＞11.1 mmol/L者為2型糖尿病造模成功。選取造模成功的19只大鼠，按血糖高低編號，用Excel表進(jìn)行隨機(jī)分組，分為2型糖尿病模型組(T組)，2型糖尿病兼抑郁癥模型組(T+D組)。

1.2.2 2型糖尿病模型成功后慢性束縛應(yīng)激模型的建立

2型糖尿病兼抑郁癥造模參考［7～10］，并進(jìn)行改良，采用本課題組長期穩(wěn)定的慢性束縛應(yīng)激抑郁模型［11］，即將2型糖尿病大鼠捆綁在自制的束縛架上造模，隨機(jī)選取時(shí)間進(jìn)行束縛，3 h/d，連續(xù)21 d。正常組及2型糖尿病組不予束縛，但在相同的時(shí)間內(nèi)禁食水。

1.2.3 觀測指標(biāo)與方法

(1)一般狀態(tài)的觀察

包括毛發(fā)，精神狀態(tài)，情緒反應(yīng)，大便，四肢耳廓皮膚黏膜，對束縛的反應(yīng)。

(2)體重及空腹血糖監(jiān)測

于慢性束縛期間的第0、7、14、21天進(jìn)行體重和空腹血糖的監(jiān)測。

(3)曠場實(shí)驗(yàn)

在安靜、遮光的環(huán)境下進(jìn)行。將大鼠放入箱內(nèi)底面中心，利用同步錄像、計(jì)時(shí)，觀察5 min內(nèi)大鼠在曠場行為測試箱內(nèi)的活動情況。每只大鼠檢測完畢后用70%乙醇清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次大鼠余留的信息(如大鼠的大、小便、氣味)影響下次測試結(jié)果。更換大鼠，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。觀察指標(biāo)如下:①總移動距離:5 min內(nèi)大鼠運(yùn)動軌跡的總長度;②移動速度:5 min內(nèi)大鼠運(yùn)動軌跡的速度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

慢性束縛期間，3只大鼠死亡，總共剩余24只大鼠。

2.1 宏觀表征

N組大鼠，皮毛順滑有光澤，精神狀態(tài)良好。T組大鼠，精神尚可，毛色發(fā)黃，體重增長緩慢，糞便、尿量增多，進(jìn)食量、飲水量增多。T+D組大鼠，造模初期焦躁，反抗力強(qiáng)，后期毛發(fā)散亂，無光澤，反抗力減弱，活動遲緩、扎堆、反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，皮膚及黏膜顏色變淺、皮毛變黃、清潔度明顯減低，大便時(shí)干時(shí)稀甚至稀溏，進(jìn)食量、飲水量增加，糞便尿量增加。

2.2 體重變化

給予高脂飼料及腹腔注射STZ制備2型糖尿病模型后，T組和T+D組在0、7、14、21 d各組大鼠體重均下降，與N組比較差異有顯著性(P＜0.05;P＜0.01)，21天慢性束縛刺激后，大鼠體重下降，T+D組體重比T組大鼠體重增加緩慢，差異有顯著性(P＜0.05)。見表1。

2.3 空腹血糖變化

給予高脂飼料及腹腔注射STZ制備2型糖尿病模型后，T組和T+D 組在0、7、14、21天各組大鼠血糖均升高，與N組比較差異有顯著性(P＜0.01)，21天慢性束縛刺激后，第21天T+D組大鼠空腹血糖比T組較高，兩組間差異有顯著性(P＜0.01)。

2.4 曠場實(shí)驗(yàn)

21d慢性束縛造模后，大鼠5 min內(nèi)總移動距離有變化，與 N組相比，T組差異無顯著性(P＞0.05)，T+D組差異有顯著性(P＜0.05)，但與T組相比，T+D組差異無顯著性(P＞0.05);大鼠5 min內(nèi)移動速度有變化，與N組相比，T組差異有顯著性(P＜0.05)，T+D組差異有顯著性(P＜0.01)，但與T組相比，T+D組差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 各組大鼠體重變化情況(g，±s，n=8)Tab.1 Body weight of the rats in each group

表1 各組大鼠體重變化情況(g，±s，n=8)Tab.1 Body weight of the rats in each group

注:與 N組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 T組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別Groups第0天Day 0第7天Day 7第14天Day 14第21天Day 21 N組 402.475±8.997 427.063±10.425 435.238±10.501 451.213±11.115 T組 357.125±12.594# 367.988±12.393## 374.525±11.813## 385.363±12.149##T+D組 349.200±11.947## 337.763±11.348## 338.234±12.791## 345.800±10.817##*

表2 各組大鼠空腹血糖變化情況(mmol/L，±s，n=8)Tab.2 Fasting blood glucose of rats in each group

表2 各組大鼠空腹血糖變化情況(mmol/L，±s，n=8)Tab.2 Fasting blood glucose of rats in each group

注:與 N組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 T組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups第0天Day 0第7天Day 7第14天Day 14第21天Day 21 N組 4.562±0.174 4.075±0.385 4.388±0.506 4.562±0.096 T組 20.075±1.268## 20.625±0.623## 21.975±0.995## 20.700±1.034##T+D組 22.375±4.579## 21.800±3.746## 23.000±3.000## 24.475±0.903##＊＊

表3 曠場實(shí)驗(yàn)大鼠5 min內(nèi)總移動距離、運(yùn)動速度(cm，cm/s，±s，n=8)Tab.3 Total movement distance(cm)and movement speed in 5 minutes of open field test

表3 曠場實(shí)驗(yàn)大鼠5 min內(nèi)總移動距離、運(yùn)動速度(cm，cm/s，±s，n=8)Tab.3 Total movement distance(cm)and movement speed in 5 minutes of open field test

注:與 N組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與 T組相比，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups總移動距離/cm Movement distance移動速度/cm/s Movement speed N組 1532.604±126.805 5.114±0.423 T組 1304.333±201.770 2.943±0.609#T+D組 940.533±208.296# 2.429±0.508##

3 討論

根據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病人群中，抑郁癥的發(fā)生與女性20～40歲、病程較長、體重指數(shù) ＞25 kg/m2、糖化血紅蛋白＞8%、無配偶支持或婚姻不完整、經(jīng)濟(jì)狀況不好、從事體力勞動、并發(fā)癥數(shù)目較多、慢性并發(fā)癥增加密切相關(guān)，其中中重度抑郁占1/3［12］。糖尿病是慢性疾病，可引起全身多器官的病變?；颊唧w重下降、形體消瘦，因血糖控制不穩(wěn)定，多臟器同時(shí)功能降低，加重患者的心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重者則抑郁，而抑郁的患者體內(nèi)某些神經(jīng)遞質(zhì)改變，又會加重血糖的升高，情緒更加低落，降低治療的依從性，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)。因此開發(fā)治療糖尿病兼抑郁癥的藥物是最迫切的項(xiàng)目之一，而要找到起效快、毒性小的藥物，動物模型的應(yīng)用必不可少。動物模型是藥物研發(fā)和機(jī)制研究中不可或缺的環(huán)節(jié)，對于評價(jià)藥物的有效性和安全性起著重要的作用，而合理的動物模型的建立和評價(jià)，能縮短動物模型和臨床疾病的特征差異，使之與臨床吻合度增高［13］。本研究綜合運(yùn)用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射STZ，并在其基礎(chǔ)上采用21天慢性束縛的方法造成大鼠的抑郁狀態(tài)，從而建立2型糖尿病兼抑郁癥大鼠模型。此實(shí)驗(yàn)中，2型糖尿病兼抑郁癥模型大鼠，造模初期焦躁，反抗力強(qiáng)，后期毛發(fā)散亂，無光澤，反抗力減弱，活動遲緩，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，進(jìn)食量、飲水量增加，糞便尿量增加，體重減輕。2型糖尿病兼抑郁癥模型大鼠較之2型糖尿病模型大鼠，在糖尿病形成的初期，即慢性束縛第0天，體重與空腹血糖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在21天慢性束縛期間，2型糖尿病兼抑郁癥模型大鼠的體重增長緩慢，空腹血糖升高，在第21天，2型糖尿病組大鼠和2型糖尿病兼抑郁癥組的體重和空腹血糖有差異，在曠場實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動距離和運(yùn)動速度都下降，而曠場實(shí)驗(yàn)是評定大鼠在新異環(huán)境中的啟動、探究行為和對新環(huán)境的警覺性。總移動距離和移動速度初步評價(jià)大鼠的自發(fā)活動度，2型糖尿病兼抑郁癥模型大鼠的總移動距離明顯小于正常大鼠和糖尿病大鼠，表明2型糖尿病兼抑郁癥模型大鼠的自發(fā)活動度減?。?4］，說明21天慢性束縛應(yīng)激抑郁模型的建立成功。這同臨床上糖尿病兼抑郁癥患者不思飲食，體重下降，興趣喪失，精神運(yùn)動改變、情緒低落，活動減少，血糖監(jiān)控較差，治療依從性低，在一定程度上有一致性，因此提示成功復(fù)制2型糖尿病兼抑郁證大鼠模型，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

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