崔永春，李凱，張宏，劉曉鵬，袁衛(wèi)民，李巨波，吳愛(ài)麗，唐躍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國(guó)家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市心血管植入材料臨床前評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037)

1型糖尿病，原名胰島素依賴型糖尿病，由于自身免疫抗體、遺傳因素、病毒感染或藥物毒性使胰島分泌胰島素的β細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷，導(dǎo)致胰體內(nèi)胰島素絕對(duì)不足，從而引發(fā)糖代謝紊亂，長(zhǎng)期高血糖為特征的多種物質(zhì)代謝紊亂綜合征。起病比較急劇，多發(fā)生在兒童和青少年，不能治愈，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，對(duì)于其疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)以及診療新方法的開(kāi)發(fā)尚需加強(qiáng)［1-2］。

建立貼近人類疾病特征的動(dòng)物模型是理解疾病發(fā)生發(fā)展病理機(jī)制、藥物新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)以及臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)等生物醫(yī)學(xué)研究的必要條件，是人類征服糖尿病疾病進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本文采用糖脂代謝與人類更加接近的小型豬作為模式動(dòng)物，同時(shí)針對(duì)小型豬胰島β細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transport protein 2，GLUT2)表達(dá)量較低的特點(diǎn)，探索通過(guò)一次性靜脈注射高劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)方法建立小型豬1型糖尿病模型，并對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，為I糖尿病相關(guān)研究提供大動(dòng)物模型支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中華實(shí)驗(yàn)小型豬，6～8月齡，8只，體重(22.6±1.8)kg，雄性。購(gòu)自北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2009-0026】。根據(jù)動(dòng)物生長(zhǎng)情況，每日喂食2次，自由飲水。實(shí)驗(yàn)受中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批，審批編號(hào)為2012-1-12-XHQN。實(shí)驗(yàn)遵循《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理指南》和《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》條例要求［3］，在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(京)2011-0011】完成。

1.2 檸檬酸鈉溶液(0.1 mol//L)的配制

檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液，檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液，將 A、B 液按比例(1∶1)混合，調(diào)節(jié) pH 4.2～4.5，即是所需配置鏈脲佐菌素的檸檬酸緩沖液。

1.3 STZ溶液的配制

按照150 mg/kg劑量，根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量稱取適量STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉(pH 4.5～5.0)溶液中，使終濃度為80 g/L。采用0.22 μm針頭式濾器過(guò)濾除菌。因STZ溶液不穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)使用新鮮配制的鏈脲佐菌素溶液。

1.4 1型糖尿病豬模型的建立

動(dòng)物禁食約16 h，利用氯胺酮(35 mg/kg)和安定(1.5 mg/kg)肌內(nèi)注射，常規(guī)麻醉動(dòng)物，耳緣靜脈一次性注入STZ溶液(150 mg/kg)建立1型糖尿病小型豬模型，于2 min內(nèi)注完。

1.5 空腹血糖的測(cè)定

分別在給藥前和給藥后10 min、30 min、90 min、第1天、第2天、第3天和第7天空腹采集血液，利用手持式JPS-5型全血葡萄糖測(cè)試儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)檢測(cè)血糖濃度。如果出現(xiàn)反應(yīng)性低血糖，靜脈注射體積分?jǐn)?shù)50%高糖(0.5 g/kg)溶液，盡量使血糖維持在正常水平;分別在給藥后1d、2 d、3 d和7 d連續(xù)監(jiān)測(cè)空腹血糖，如果連續(xù)7 d空腹血糖濃度均≥7 mmol/L則認(rèn)為糖尿病模型成功。

1.6 靜脈葡萄糖耐量(IVGTT)試驗(yàn)

在STZ注射后7 d，動(dòng)物空腹靜脈注射葡萄糖0.5 g/kg，總量不超過(guò)50 g，于注射前及注射后60、120 min采集血液檢測(cè)血糖，并利用德國(guó)西門子ACS-180 Plus全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)血胰島素及C肽水平［4］，以鑒定糖尿病模型的類型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

納入小型豬8只，均進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)死亡和感染，無(wú)脫失值。

2.2 1型糖尿病小型豬空腹血糖監(jiān)測(cè)

為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)糖尿病小型豬空腹血糖水平，分別在給藥前、給藥后10 min、30 min、90 min、第1 天、第2天、第3天和第7天分別采集外周血，利用血糖監(jiān)測(cè)儀測(cè)定空腹血糖。結(jié)果如表1所示，自鏈脲佐菌素給藥后第1天開(kāi)始，血糖明顯升高并穩(wěn)定維持在16.7～20.6 mmol/L濃度水平，與給藥前相比，明顯升高(P＜0.01)，說(shuō)明空腹血糖達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(≥7 mmol/L)。

表1 糖尿病小型豬空腹血糖的測(cè)定(±s，n=8)Tab.1 Fasting blood-glucose in the minipigs

表1 糖尿病小型豬空腹血糖的測(cè)定(±s，n=8)Tab.1 Fasting blood-glucose in the minipigs

注:與給藥前比較，*P＜0.05。BA:給藥前;PA:給藥后。PA d1:給藥后第1天;PA d2:給藥后第2天;PA d3:給藥后第3天;PA d7:給藥后第7天。Note.*P＜0.05 vs.BA.BA:Before STZ adminitration;PA:Post STZ administration。PA d1:First day post administration;PA d2:Second day post administration;PA d3:Third day post administration;PA d7:Seventh day post administration.

時(shí)間點(diǎn)Time points空腹血糖濃度/mmol/L Fasting blood-glucose concentration P值P value BA 3.06±0.81 -PA 10 min 5.43±1.66 0.12 PA 30 min 5.56±1.57 0.18 PA 90 min 6.03±1.21 0.08 PA d1 16.81±0.52* 0.03 PA d2 19.13±0.61* 0.02 PA d3 19.71±0.55* 0.04 PA d7 19.75±0.49*0.02

2.3 靜脈糖耐量試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定糖尿病分型，實(shí)驗(yàn)于給藥后1周進(jìn)行了靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)和C肽釋放試驗(yàn)(見(jiàn)表2)。靜脈注射50%葡萄糖后1 h，8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖均明顯升高，達(dá)到26 mmol/L左右(＞11.1 mmol/L臨界值);在注糖2 h后仍維持在較高水平(約25 mmol/L);而血胰島素始終變化不明顯。C肽釋放規(guī)律檢測(cè)結(jié)果與血胰島素變化情況相近，注糖后1～2 h與空腹水平比較，差異均無(wú)顯著性，而且給予STZ后的空腹血C肽水平較給藥前(0.22±0.08 nmol/L vs.0.56±0.29 nmol/L)明顯降低(P＜0.05)，這符合1型糖尿病特征。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血糖和胰島素檢測(cè)結(jié)果(±s，n=8)Tab.2 Results of intravenous glucose tolerance test at different time points

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血糖和胰島素檢測(cè)結(jié)果(±s，n=8)Tab.2 Results of intravenous glucose tolerance test at different time points

注:*P＜0.05 vs.STZ給藥前，＊＊P＜0.05 vs.注糖前空腹血糖。Note:*P ＜0.05 vs.before STZ administration，＊＊ P ＜0.05 vs.fasting blood glucose level before glucose injection

時(shí)間點(diǎn)Time points血糖濃度/mmol/L Blood glucose血清胰島素/mU/dL Blood insulin血C肽濃度/nmol/L Blood C peptide STZ給藥前(Before STZ) 3.06±0.81 15.65±0.19 0.56±0.29 1.98±0.51 0.21±0.06 STZ給藥后1周(1 week after STZ administration)注糖前(Before glucose inj.) 13.32±1.31* 2.23±0.21* 0.22±0.08*注糖后1 h(1 h after glucose inj.) 26.23±0.21＊＊ 1.54±0.82 0.28±0.02注糖后 2 h(2 h after glucose inj.) 25.15 ±2.21＊＊

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外研究常用的1型糖尿病動(dòng)物模型包括:①自發(fā)性糖尿病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型(如NOD小鼠、BB 糖尿病大鼠)［5-9］;②柯薩奇病毒感染法［10-12］;③胰腺切除法［13，14］;④化學(xué)藥物誘導(dǎo)法［15，16］。其中，自發(fā)性糖尿病模型及病毒誘導(dǎo)法均適用于小動(dòng)物，但嚙齒類動(dòng)物病理生理過(guò)程與人類相去甚遠(yuǎn)，在歐美多項(xiàng)大規(guī)模、多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)利用嚙齒類動(dòng)物獲得的藥效學(xué)結(jié)果與臨床研究結(jié)果嚴(yán)重脫節(jié)，因此近些年來(lái)人們積極探索與優(yōu)化大動(dòng)物模型的建立方法［17］。

鑒于胰腺法切除對(duì)動(dòng)物造成較大傷害，影響其健康狀況。因此，本研究擬利用化學(xué)藥物破壞胰島β細(xì)胞法建立糖尿病小型豬模型?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑主要包括鏈脲佐菌素STZ和四氧嘧啶2種藥物，但兩種方法比較，鏈脲佐菌素優(yōu)于四氧嘧啶，因其造模穩(wěn)定、快速、種屬選擇性不強(qiáng)、復(fù)制模型前不需要嚴(yán)格禁食等［18-21］。

應(yīng)用STZ建立1型糖尿病模型是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的方法［22-25］。它經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2進(jìn)入胰腺胰島β細(xì)胞，通過(guò)DNA烷基化及ADP核糖基化作用誘發(fā)β細(xì)胞變性壞死，胰島素缺失與血糖升高，引發(fā)糖尿?。?6］。因?yàn)樨i的胰島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2表達(dá)量較其他物種(如鼠和犬)低，因此在建立小型豬糖尿病模型時(shí)，需要倍加鏈脲佐菌素劑量(100 ～ 200 mg/kg)［27-30］。因此，本研究采用靜脈一次性注射高劑量(150 mg/kg)STZ方法建立小型豬糖尿病模型。

空腹血糖測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與給藥前相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在靜脈注射STZ后1天開(kāi)始，空腹血糖已經(jīng)持續(xù)升高，高于7 mmol/L的診斷標(biāo)準(zhǔn)。靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)和C肽釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靜脈注射體積分?jǐn)?shù)50%葡萄糖1 h后模型豬血糖濃度高于11.1 mmol/L，2 h后未能恢復(fù)至空腹血糖水平;而胰島素和C肽在注入葡萄糖后基本未發(fā)生任何反應(yīng)，說(shuō)明模型組胰島β細(xì)胞分泌胰島素和C肽功能已經(jīng)喪失。根據(jù)2010年ADA糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，上述參數(shù)變化特征符合1型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明建模成功。

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