孟哲穎，王玉，南淑良，林艷端，徐衛(wèi)平，胡兵，申鍔

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科;上海超聲醫(yī)學(xué)研究所，上海 200233)

糖尿病心肌病 (diabetic cardiomyopathy，DC)［1］是由高血糖直接作用心肌細(xì)胞引起的心肌組織原發(fā)性損害，病理表現(xiàn)不具有特異性。在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞肥大及心肌組織膠原成分累積導(dǎo)致心肌纖維化，逐漸加重并最終致心力衰竭，如何減輕、阻止、逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌病的病理變化及其分子機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、具有22個(gè)左右核苷酸大小的非編碼RNA分子，在進(jìn)化中呈現(xiàn)高度保守性，通過堿基匹配原則識(shí)別靶基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的靶位點(diǎn)，從而抑制編碼蛋白靶基因的翻譯和(或)降解靶基因［2］。本文擬用 miR-182 模擬物［3］(正義鏈:5'-uuuggcaaugguagaacucacacu-3'，反義鏈:5'-agugugaguucuaccauugccaaa-3')治療1型糖尿病小鼠，探索miR-182與糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，及miR-182模擬物是否影響小鼠心臟功能和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

SPF級(jí)C57 BL/6J小鼠40只，雄性，鼠齡5～6周，體重18～20 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2007-0005】，實(shí)驗(yàn)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行【SYXK(滬)2011-0128】。隨機(jī)分為4組:正常對照組(normal control，n=5)，miR-182 模擬物對照組(mir-182 control，n=5)，1型糖尿病組 (DM，n=15)，1型糖尿病+miR-182模擬物治療組(DM+miR-182，n=15)。鼠齡8周時(shí)通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立1型糖尿病動(dòng)物模型，注射劑量為150 mg/kg，一次性注射，當(dāng)天即讓小鼠自由進(jìn)食飲水。注射STZ后48 h經(jīng)鼠尾靜脈釆血，血糖大于16.7 mmol/L定為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，血糖升高后DM+miR-182組小鼠每3 d經(jīng)尾靜脈注射中性脂肪乳劑和miR-182模擬物合成的載藥系統(tǒng)，劑量為1 mg/kg，連續(xù)給藥8周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束［3］。miR-182對照組只注射中性脂肪乳劑，給藥劑量及時(shí)間同DM+miR-182組。

1.2 主要試劑及儀器

Streptozotocin(STZ，Sigma公司，美國)，Onetouch II血糖儀(強(qiáng)生公司，美國);透射電鏡(l200Ex，日本);小動(dòng)物用高分辨超聲儀(Vevo 2100，VisualSonics公司，加拿大);中性脂肪乳劑和miR-182模擬物合成的寡核苷酸載藥系統(tǒng)及Trizol試劑(Sigma公司，美國)。

1.3 超聲心動(dòng)圖測量心臟功能

實(shí)驗(yàn)達(dá)終點(diǎn)時(shí)，通過小動(dòng)物用高分辨超聲儀檢測小鼠心臟功能:按照高分辨小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)的操作說明，麻醉采用1.5%戊巴比妥鈉按0.1 mL/20 g腹腔注射，然后將其置于37℃的恒溫墊上，用4個(gè)電極連接小鼠四肢末端并固定。獲取胸骨旁長軸切面M型超聲圖像，測定左心室舒張末期內(nèi)徑LVIDd，左室收縮末期內(nèi)徑LVIDs，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，軟件自動(dòng)測算出左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)，左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)s)。

1.4 透射電鏡檢測

小鼠心臟剪去心房、右室及大血管組織，取左室心肌組織，切成大小約為1 mm3組織塊，放入3%戊二醛固定液固定2 h，l% 鋨酸固定2 h，逐級(jí)酒精、丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色后，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。余心臟組織迅速凍于液氮中并轉(zhuǎn)存在-80℃冰箱，后續(xù)試驗(yàn)待用。

1.5 Real-time RT-PCR檢測

用Trizol試劑抽提總RNA，進(jìn)行濃度和純度檢測，取2 μg總RNA按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，合成 cDNA，加入 SYBR Premix ExTaq，行PCR循環(huán)。檢測目的基因β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、α-肌球蛋白 重鏈 (α-MHC)，心房鈉尿肽(ANP)，I型(Col I)和III型膠原(Col III)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3·phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，檢測miR-182 mRNA，U6為內(nèi)參，具體引物序列見表1?？偡磻?yīng)體積20 μL，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 60 s，62℃ 40 s，72℃ 60 s，最后延伸10 min，目的基因擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，內(nèi)參擴(kuò)增27個(gè)循環(huán)。以目的基因 β-MHC、α-MHC、ANP、Col I、Col III與 GAPDH比率進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用 q檢驗(yàn)。P＜0.05及P＜0.01為差異有顯著性。

表1 β-MHC，α-MHC，ANP，Col I，Col III，miR-182及 U6，GAPDH 的 PCR 擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences of β-MHC，α-MHC，ANP，Col I，Col III，miR-182，U6 and GAPDH

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠心臟功能變化

與正常對照組比較，DM組小鼠心臟功能參數(shù)EF和Fs明顯降低(P＜0.01);而DM+miR-182組較DM組EF和FS明顯升高(P＜0.01);但miR-182對照組與正常對照組差異無顯著性(P＞0.05)，見圖1、表2。各組小鼠體重及血糖變化，見表3。

圖1 小鼠心臟超聲表現(xiàn)Fig.1 Echocardiography performance of the mice

表2 小鼠心臟功能變化(±s，%)Tab.2 Cardiac function of the mice in each group

表2 小鼠心臟功能變化(±s，%)Tab.2 Cardiac function of the mice in each group

注:#P＜0.01 vs正常對照組;*P＜0.01 vs1型糖尿病組。Note:#P＜0.01 vs.normal control group;*P＜0.01 vs.DM group.

組別Groups EF FS正常對照組Normal control 81.204±2.904 50.819±2.173 miR-182模擬物對照組miR-182 control 82.068±1.713 51.182±2.733 1型糖尿病組TypeⅠDM 54.881±3.042# 24.035±1.528*1型糖尿病+miR-182模擬物治療組TypeⅠDM+miR-182 68.913±3.860# 37.314±2.782*

2.2 小鼠心肌組織miR-182 mRNA的表達(dá)

與正常對照組比較，DM組心肌組織內(nèi)miR-182 mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)見圖2;小鼠心肌組織的β/α-MHC比值及 ANP，Col I，Col III表達(dá)變化，與正常對照組比較，DM組心肌組織內(nèi) β/α-MHC比值及ANP、Col I、Col III表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.01);DM+miR-182組較DM組顯著降低(P＜0.01);但miR-182組與正常對照組差異無顯著性(P＞0.05)，見圖3。

2.3 小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡結(jié)果顯示miR-182對照組與正常對照組呈現(xiàn)心肌纖維豐富呈縱向平行緊密排列，Z線和M線清晰，線粒體呈圓形或橢圓形，基質(zhì)濃密、嵴完整且豐富，延長軸有序排列在肌絲束之間;DM組呈現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)纖維增生;心肌細(xì)胞間出現(xiàn)較多脂滴，線粒體排列聚集紊亂，形態(tài)異常，線粒體明顯腫脹，嵴溶解或消失，心肌細(xì)胞間出現(xiàn)自噬體(見圖4-e，箭頭所示);DM+miR-182組呈現(xiàn)線粒體改變有所改善，體現(xiàn)在線粒體嵴溶解斷裂較少，嵴稍腫脹，未見明顯自噬體，見圖4。

表3 各組小鼠體重及血糖變化(±s)Tab.3 Changes of body weight and blood glucose of the mice in each group

表3 各組小鼠體重及血糖變化(±s)Tab.3 Changes of body weight and blood glucose of the mice in each group

注:#P＜0.01 vs.正常對照組血糖值;＊P＜0.01 vs.STZ注射8周后正常對照組體重。Note:#P＜0.01 vs.blood glucose of normal control group;＊P＜0.01 vs.body weight of the normal control group at 8 weeks after STZ injection.

組別STZ注射后48 hDM 建模成功時(shí) STZ注射后8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重B.W./g 血糖/mmol/L 體重B.W./g 血糖/mmol/L正常對照組 Normal control 22.8±0.6 7.9±1.4 27.9±1.5 7.4±1.8 miR-182模擬物對照組 miR-182 control 22.9±0.4 7.0±1.8 28.2±2.1 6.9±0.9 1型糖尿病組DM 23.4±0.9 21.2±2.3# 18.9±1.1* 25.5±2.1#1型糖尿病+miR-182模擬物治療組DM+miR-182 23.7±0.8 22.8±1.7# 22.2±2.8*Groups 14.2+2.6

圖2 小鼠心肌組織miR-182 mRNA表達(dá)變化Fig.2 Changes of miR-182 in the cardiac tissues of mice in normal control group and DM group

圖3 小鼠心肌組織β/α-MHC比值及 ANP，Col I，Col III表達(dá)變化Note:#P＜0.01 vs.normal control group;＊P＜0.01 vs.DM group;A:Normal control group;B:miR-182 control group;C:DM group;D:DM+miR-182 groupFig.3 Changes of β/α-MHC ratio，ANP，Col I，Col III in the myocardial tissues of mice in each group

圖4 小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化，各組小鼠心肌組織線粒體及自噬改變Fig.4 Ultrastructural changes in the myocardial tissues of mice

3 討論

MiRNAs在人類基因中約占3%，卻控制著近30%的基因表達(dá)，既參與調(diào)節(jié)組織、器官的形成以及增殖、代謝、造血等細(xì)胞生理過程，也在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2，5］。miRNA可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平影響蛋白的產(chǎn)生從而參與心肌肥大的形成，近來研究表明，miRNAs，如miR-26b、miR-150、miR-27a及 miR-143與心肌肥大的病理生理有密切聯(lián)系［6］。同時(shí)在糖尿病小鼠心肌組織已發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的 miRNAs［7］，提示 miRNA參與 DC的發(fā)生發(fā)展。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2型糖尿病小鼠心肌組織中有miRNAs表達(dá)下調(diào)，其中mir-182的表達(dá)水平減低最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，那么mir-182在1型糖尿病小鼠心肌組織中是否也呈下調(diào)表達(dá)?調(diào)控miR-182是否影響小鼠心臟功能。本實(shí)驗(yàn)以1型糖尿病小鼠為動(dòng)物模型，首先測量糖尿病小鼠的心臟功能，因小鼠心率可高達(dá)約600～700次/分鐘，即使小鼠進(jìn)行麻醉后，心率仍可達(dá)到300次/分鐘(麻藥對心臟功能改變沒有明顯影響)，在此情況下醫(yī)用心超儀器難以對小鼠心臟功能進(jìn)行準(zhǔn)確測量。本實(shí)驗(yàn)采用小動(dòng)物專用高分辨超聲儀對小鼠左心室EF、FS進(jìn)行測量，可以有效檢測小鼠整體心臟收縮功能變化［2，9］，心臟超聲參數(shù) EF、Fs 是反映心臟收縮功能的金指標(biāo)，結(jié)果顯示DM組小鼠心臟EF與Fs明顯降低，1型糖尿病小鼠給予miR-182模擬物后心臟EF與Fs均有不同程度增高，提示miR-182模擬物可以改善糖尿病心肌病造成的心臟功能損害。

心肌肥大、心肌纖維化是心功能減低的重要原因。ANP和β/α-MHC比值是反映心肌肥大的代表性指標(biāo)［8］。本實(shí)驗(yàn)中DM組心肌組織中ANP表達(dá)明顯增加、β/αMHC比值明顯升高，而 DM+miR-182組心肌ANP表達(dá)水平和β/α-MHC比值顯著降低，表明miR-182模擬物發(fā)揮心臟保護(hù)作用與減輕心肌肥大相關(guān)。心肌間質(zhì)纖維化可能是糖尿病心肌病變的特征性表現(xiàn)，其中成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的作用和糖尿病心肌病心室重構(gòu)的關(guān)系備受關(guān)注［9，10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DM組心肌間質(zhì)大量膠原纖維積累，同時(shí)DM組心肌組織內(nèi)Col I及Col III膠原顯著增加，而DM+miR-182組明顯降低，提示miR-182參與DC發(fā)病，其模擬物可以降低心肌組織中膠原的含量，減輕糖尿病心肌病造成的心臟結(jié)構(gòu)損害，提示miR-182模擬物改善糖尿病小鼠心功能與其減輕心肌肥大，心肌纖維化有關(guān)。

自噬(autophagy)［11是機(jī)體處于物質(zhì)與能量代謝障礙時(shí)由細(xì)胞初級(jí)溶酶體處理內(nèi)容性底物的重要生理過程，是機(jī)體主要的防御機(jī)制之一，以胞質(zhì)中出現(xiàn)大量包裹胞質(zhì)、細(xì)胞器的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體為主要特征。糖尿病心肌能量障礙會(huì)誘導(dǎo)自噬，但是糖尿病心肌病變時(shí)如何誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生自噬以及自噬在細(xì)胞存活與死亡中的作用尚存在爭議。有學(xué)者［12］認(rèn)為糖尿病小鼠腺苷酸活化蛋白激酶AMPK活性降低，自噬減少是導(dǎo)致糖尿病心肌病的原因之一;然而相反的觀點(diǎn)［13］認(rèn)為高糖導(dǎo)致胰島素抵抗所致超氧化物過多，上調(diào)自噬，可能會(huì)誘導(dǎo)糖尿病心肌病。高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡與ROS產(chǎn)生增多、促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、激活自噬有關(guān)［14］。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到DM組小鼠心肌中自噬體較正常對照組明顯增多，而給予mir-182模擬物治療后自噬小體明顯減少。最近的文獻(xiàn)表明［15］miR-34可通過抑制ATG9A的表達(dá)，抑制心肌自噬參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大，提示心肌自噬對于心肌肥大的影響，因此miR-182模擬物減輕心肌自噬的分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)顯示miR-182模擬物可以提高1型糖尿病小鼠心臟EF、Fs從而改善心臟功能，主要是通過減低心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因、致心肌纖維化膠原基因的表達(dá)，減低細(xì)胞線粒體改變、減少心肌組織自噬小體數(shù)量而實(shí)現(xiàn)，因而上調(diào)miR-182有望成為改善糖尿病心臟功能以及防治糖尿病心肌病的治療靶點(diǎn)。

［1］Rubler S，Dlugash J，Yuceoglu YZ，et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis［J］.Am J Cardiol，1972，6(30):595-602.

［2］Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?［J］.Nat Rev Genet，2008，9(2):102-114.

［3］Small EM，，Olson EN.Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology［J］.Nature，2011，469(7330):336-342.

［4］Trang P，Wiggins JF，Daige CL，et al.Systemic delivery of tumor suppressor microRNA mimics using a neutral lipid emulsion inhibits lung tumors in mice［J］.Mol Ther，2011，19(6):1116-1122.

［5］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 ［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［6］Martinelli NC，Cohen CR，Santos KG，et al.An analysis of the global expression of microRNAs in an experimental model of physiological left ventricular hypertrophy ［J］.PLoS ONE，2014，9(4):e93271.

［7］刁雪紅，申鍔，胡兵，等.糖尿病小鼠心肌組織microRNA表達(dá)譜分析［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(10):1194-1198.

［8］Patrizio M，Musumeci M，Stati T，et al.Propranolol causes a paradoxical enhancement of cardiomyocyte foetal gene response to hypertrophic stimuli［J］.Br J Pharmacol，2007，152(2):216-222.

［9］Asbun J，Villarreal FJ.The pathogenesis of myocardial fibrosis in the setting of diabetic cardiomyopathy ［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47(4):693-700.

［10］Yang B，Li M，Shi ZG，et al.Bosentan ameliorates the expression of fibrotic related growth factors and collagen-1 in diabetic mice［J］.Anadolu Kardiyol Derg，2012，12(8):621-627.

［11］Zhu H，Tannous P，Johnstone JL，et al.Cardiac autophagy is a maladaptive response to hemodynamic stress［J］.J Clin Invest，2007，117(7):1782-1793.

［12］Xie Z，Lau K，Eby B，et al.Improvement of cardiac functions by chronic metformin treatment is associated with enhanced cardiac autophagy in diabetic OVE26 mice［J］.Diabetes，2011，60(6):1770-1778.

［13］Mellor KM，Bell JR，Young MJ，et al.Myocardial autophagy activation and suppressed survival signaling is associated with insulin resistance in fructose-fed mice［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50(6):1035-1043.

［14］Younce CW，Wang K，Kolattukudy PE.Hyperglycaemia-induced cardiomyocyte death is mediated via MCP-1 production and induction of a novel zinc-finger protein MCPIP ［J］.Cardiovasc Res，2010，87(4):665-674.

［15］Huang J，Sun W，Huang H，et al.miR-34a modulates angiotensin II-induced myocardial hypertrophy by direct inhibition of ATG9A expression and autophagic activity ［J］.PLoS One，2014，9(4):e94382.