魏 銘 王彩霞 邢建民

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 3.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

高效液相色譜法測定玉米秸稈預(yù)處理過程的抑制物

魏 銘1王彩霞2,3邢建民3

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 3.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

使用玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，在預(yù)處理時(shí)會(huì)產(chǎn)生糠醛、4-對羥甲基苯甲醛、5-羥甲基糠醛、丁香醛等抑制物，抑制發(fā)酵過程的進(jìn)行。通過建立4種抑制物的最佳高效液相分析方法，結(jié)果表明，在流動(dòng)相比例為30%甲醇-70%超純水、流速為0.8 mL/min時(shí)，采用YMC-Triart C18(250×4.6 mm L.D.)色譜柱，各物質(zhì)的分離效果最好；分別繪制4種抑制物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示各抑制物濃度在0.001～1.000 g/L范圍內(nèi)，回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999以上，呈良好線性關(guān)系。采用該方法檢測玉米秸稈預(yù)處理后抑制物的濃度，發(fā)現(xiàn)稀酸預(yù)處理和高溫水熱預(yù)處理產(chǎn)生的抑制物濃度基本相同。

玉米秸稈；丁二酸；抑制物；高效液相色譜

丁二酸(succinic acid)，又名琥珀酸，是一種常見的天然有機(jī)酸，與其他二元酸不同，丁二酸分子包含2個(gè)活潑的亞甲基，因此具有許多化學(xué)特性，如鹵化、脫水、氧化、還原、酯化、?；?、磺化等[1]。作為一種重要的有機(jī)化工原料及中間體，丁二酸廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)以及食品業(yè)[2-3]。傳統(tǒng)的化學(xué)方法生產(chǎn)丁二酸主要是采用丁烷為原料，產(chǎn)生中間體順丁烯二酸酐，然后在催化劑的作用下進(jìn)行加氫反應(yīng)，得到終產(chǎn)物丁二酸，雖然這種方法生產(chǎn)工藝相對比較成熟，但要消耗不可再生的石化資源，而且對環(huán)境造成污染，嚴(yán)重抑制了丁二酸作為大宗化學(xué)品的發(fā)展?jié)摿4-6]。

發(fā)酵法是指微生物菌種以可再生糖源(如農(nóng)作物秸稈、糖蜜)為主要原料，通過發(fā)酵過程生產(chǎn)丁二酸，該方法成本低廉，環(huán)境友好[7-8]。近年來，由于石油危機(jī)及環(huán)境污染的雙重壓力，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸以其具有節(jié)約大量的石油資源并且可以降低由石化方法產(chǎn)生的污染等優(yōu)點(diǎn)，而受到廣泛關(guān)注，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，利用秸稈為原料生產(chǎn)丁二酸已經(jīng)取得了令人鼓舞的研究進(jìn)展，但是具體操作過程依然存在一些有待解決的難題，最突出的問題在于對秸稈進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一些阻礙菌體生長的抑制物，如糠醛、羥甲基糠醛等，這些抑制物使得酶解效率降低，進(jìn)而影響到后續(xù)的發(fā)酵過程[9-11]。因此，本研究通過確立4種常見抑制物(糠醛、4-對羥甲基苯甲醛、5-羥甲基糠醛、丁香醛)的液相分析條件,建立各物質(zhì)的液相標(biāo)準(zhǔn)曲線，以期實(shí)現(xiàn)抑制物在發(fā)酵樣品中的精確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糠醛(西隴化工股份有限公司)；4-對羥甲基苯甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；5-羥甲基糠醛(阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司)；丁香醛(阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司)；以上試劑均為色譜純。

全溫?fù)u瓶柜(HYG-A，太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠)；蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；超純水儀(EASYPURE Ⅱ，Thermo)；離子色譜(ICS-900，戴安)；離心機(jī)(Mini spin，Eppendorf)；pH電極(DELTA 320，METTLER)；無菌操作臺(tái)(SW-CJ-LF，蘇凈安泰)；紫外分光光度計(jì)(U-2910，日立)；超低溫冰箱(-86℃ ULT，Thermo)；旋渦混合器(XH-C，金壇市醫(yī)療儀器廠)；超聲波清洗器(KQ2200E，昆山市超聲儀器有限公司)；反應(yīng)釜控制儀(VHF，山東威海自控反應(yīng)釜有限公司)；厭氧培養(yǎng)箱(YQX-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將流動(dòng)相甲醇和超純水的比例設(shè)為5個(gè)梯度(30%甲醇-70%超純水，35%甲醇-65%超純水，40%甲醇-60%超純水，45%甲醇-55%超純水，50%甲醇-50%超純水)，流速設(shè)為3個(gè)梯度(0.6、0.8、1.0 mL/min)，用4種抑制物(糠醛，4-對羥甲基苯甲醛，5-羥甲基糠醛，丁香醛)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.500 g/L)分別進(jìn)樣，檢測分離度。

將4種抑制物分別配成濃度為1.000、0.500、0.200、0.100、0.005、0.001 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后分別進(jìn)樣(進(jìn)樣量：10 μL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)用糠醛和5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.500 g/L)重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行精密度驗(yàn)證。

1.3 玉米秸稈不同預(yù)處理后抑制物含量的測定

1.3.1 稀酸預(yù)處理 將粉碎的天然干燥秸稈過40目篩后，在500 mL的三角瓶中稱取22.5 g秸稈，用300 mL去離子水溶解，使得秸稈的固含量為7.5%(每100 mL的溶液中有7.5 g的秸稈裝入量)，小心加入1 mL濃硫酸(加入后濃度為1%)，混勻，封口。放入滅菌鍋中，于121 ℃處理90 min。結(jié)束后，對樣品抽濾，實(shí)現(xiàn)固液分離，得到的固體即為稀酸預(yù)處理后的物料。稱取少量固體放入烘箱，剩余固體和液體分別放入4℃冰箱。

1.3.2 高溫水熱預(yù)處理 將粉碎的天然干燥秸稈過40目篩后，稱取11.25 g于250 mL的三角瓶中，用150 mL水溶解(使其固含量為7.5%)。混勻后，倒入反應(yīng)釜控制儀中，185 ℃處理40 min[12]。結(jié)束后，對樣品抽濾，實(shí)現(xiàn)固液分離，稱取少量固體放入烘箱，剩余固體和液體分別放入4℃冰箱。

將所有固液分離得到的液體取樣，稀釋10倍后，檢測主要抑制物的濃度。

1.4 分析方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定使用美國安捷倫科技公司的Agilent 1200系列液相色譜分析儀。紫外檢測器：DAD JP62359428；分析柱：YMC-TriartC18(250×4.6 mm L.D.)；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

玉米秸稈預(yù)處理后抑制物的檢測使用美國安捷倫科技公司的Agilent 1200系列液相色譜分析儀。紫外檢測器：DAD DE64257480；分析柱：HPX-87H(BioRad,USA)，300×7.8 mm；柱溫：50 ℃；流動(dòng)相：硫酸(0.005 mol/L)；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

以甲醇和超純水為流動(dòng)相，考察流速為0.6 mL/min時(shí)不同流動(dòng)相比例對4種抑制物分離度的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，甲醇比例為30%時(shí)，各物質(zhì)得到了很好的分離，此時(shí)保留時(shí)間最長為32.5 min。隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增大，保留時(shí)間提前且間隔變短，分離效果變差。特別是甲醇比例為40%和45%時(shí)，后2個(gè)峰粘連在一起，出現(xiàn)重疊，不能很好地分離。而甲醇比例為50%時(shí)，一種物質(zhì)無明顯響應(yīng)值，無法檢測其存在。因此，流動(dòng)相的比例選擇為30%甲醇-70%超純水。

不同流速下各物質(zhì)的液相分離圖譜見圖2，從圖2中可以看出，流速為0.6 mL/min時(shí)，盡管各物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了較好的分離，但保留時(shí)間拖后太多，不利于后面試驗(yàn)的開展；流速為1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間最短，但是由于流速過快導(dǎo)致柱壓較高(流速0.6 mL/min時(shí)柱壓為119 bar，流速0.8 mL/min時(shí)柱壓為136 bar，流速1.0 mL/min時(shí)柱壓為144 bar)，會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。因此，流速選擇為0.8 mL/min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照2.1中建立的色譜分析方法進(jìn)行4種抑制物的含量測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。從圖3中看出，各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均在0.999以上，在0.001～1.000 g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

選取糠醛和5-羥甲基糠醛2種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 g/L)進(jìn)行精密度試驗(yàn)，并根據(jù)回歸方程計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)液濃度。由表1～2可知，保留時(shí)間及2種標(biāo)準(zhǔn)品濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)差均在5%以下，故本試驗(yàn)具有良好的重現(xiàn)性，色譜條件合理。

表1 糠醛測定的重復(fù)性試驗(yàn)

2.3 玉米秸稈預(yù)處理試驗(yàn)結(jié)果

將稀酸預(yù)處理和高溫水熱預(yù)處理后固液分離得到的液體樣品，按照2.1建立的方法，進(jìn)行抑制物濃度的檢測，檢測結(jié)果見圖4。根據(jù)該結(jié)果換算出各物質(zhì)的濃度，見表3。結(jié)果表明，稀酸和高溫水熱2種預(yù)處理方式產(chǎn)生的主要抑制物濃度差別不大，由此預(yù)測其對酶解過程產(chǎn)生的抑制作用基本相同。

表3 秸稈預(yù)處理后各抑制物的濃度

3 結(jié) 論

采用甲醇-超純水為流動(dòng)相對發(fā)酵抑制物進(jìn)行高效液相色譜分析，當(dāng)甲醇與超純水的比例為30%～70%，流速為0.8 mL/min時(shí)，可以使糠醛、4-對羥甲基苯甲醛、5-羥甲基糠醛、丁香醛四種抑制物得到較好的分離。以上物質(zhì)在0.001～1.000 g/L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并通過精密度驗(yàn)證。用此方法對玉米秸稈不同預(yù)處理后的抑制物含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，2種預(yù)處理方式產(chǎn)生的抑制物濃度基本相同。

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(責(zé)任編輯 曹 龍)

Determination of Inhibitors in Pretreatment Corn Straw by Using High Performance Liquid Chromatography

WEI Ming1, WANG Cai-xia2,3, XING Jian-min3

(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100700,China; 3.National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)

In the process of getting succinic acid from by corn straw fermentation, furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 4-Hydroxybenzaldehyde and syringaldehyde always appears at pretreatment stage. This paper established an optimum method by high performance liquid chromatography to analyze these four inhibitors. Results showed that inhibitors were well-separated under the optimized mobile phase (30%methanol- 70% ultrapure water) with a flow rate of 0.8 mL/min on the YMC-Triart C18 column. The Standard curves of four inhibitors indicated that the concentration of all inhibitors was range of 0.001-1.000 g/L, the linear correlation coefficients were above 0.999. The concentration of these inhibitors produced in corn stover pretrearment was measured by using the methods and the result showed that, the concentration of inhibitors produced in the processes of pretreatment of dilute acid and pretreatment of hydrothermal was same.

corn straw; succinic acid ; inhibitor；HPLC

2014-05-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃863項(xiàng)目(2012AA101807，2011AA02A203，2012AA022301)資助。

邢建民(1967—)，男，博士，研究員。研究方向：生物催化與代謝工程。Email：jmxing@home.ipe.ac.cn。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.06.015

S784

A

2095-1914(2014)06-0085-06

第1作者：魏銘(1991—)，女，碩士生。研究方向：食品生物技術(shù)。Email：bjfuweiming@163.com。