曹晉靜+康冀川

摘要：采用PDA培養(yǎng)基對151株喜樹內生真菌進行發(fā)酵，未篩選出產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內生真菌，而采用喜樹種子煎汁作為誘導物進行誘導培養(yǎng)，即在PDA培養(yǎng)基中加入了喜樹種子的煎汁，結果從151株內生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。試驗篩選出了能產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內生真菌。

關鍵詞：喜樹；喜樹堿；內生真菌

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0565-04

喜樹 （Camptothecaa cuminata Decne.）又名旱蓮木、千仗樹，屬珙桐科（藍果樹科、紫樹科）（Nyssaceae）喜樹屬（Camptotheca Decne.），多年生亞熱帶落葉闊葉樹，是我國特有的樹種，在我國的分布較為廣闊，南至云南的西雙版納，北至山西秦嶺地區(qū)[1]。喜樹中含有多種有活性的化合物，如喜樹堿、喜樹次堿，10-羥基喜樹堿等。研究表明，喜樹堿及其衍生物具有顯著的抗腫瘤活性，現(xiàn)已用于直腸癌及卵巢癌的臨床治療[2]。從植物內生真菌與寄主植物同步演化關系推測，喜樹內生真菌的代謝產(chǎn)物中可能含有喜樹堿及其衍生物[3]。目前對于喜樹的研究主要集中在喜樹堿及其衍生物的提取、純化、檢測等工藝上，而對其內生真菌代謝產(chǎn)物的研究報道較少。以內生真菌與植物的特殊關系為切入點研究喜樹內生真菌與喜樹堿及其衍生物的相關性，可以為喜樹堿及其衍生物的開發(fā)以及為尋找新型抗癌藥物開辟一條新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)基

從喜樹根、莖、葉、果實中分離得到151株內生真菌。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：沸煮后的馬鈴薯汁加葡萄糖20 g，不加瓊脂，滅菌。喜樹種子煎汁培養(yǎng)基：稱取50 g喜樹種子粉碎后煮沸30 min，添加到100 mL PDA培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別精確稱取喜樹堿及10-羥基喜樹堿標準品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）溶解，超聲波助溶，最后定容，濃度分別為0.1、0.05 mg/mL。

1.2.2 菌株的發(fā)酵及樣品溶液的制備 采用兩種培養(yǎng)基對待測菌株進行液體發(fā)酵，一是PDA培養(yǎng)基，二是喜樹種子煎汁培養(yǎng)基。滅菌后接入一定量的菌絲體， 28 ℃、120 r/min 旋轉培養(yǎng)，7 d后將發(fā)酵液用2層紗布過濾得到菌絲球，40 ℃干燥，粉碎。

菌絲體處理方法：稱取1.5～2.0 g粉碎后的菌絲，加入甲醇（分析純）5 mL，超聲波破碎30 min，靜置24 h，取其上清液并用甲醇補足損失的重量，12 000 r/min離心10 min，重復兩次，0.45 μm纖維慮膜過濾。發(fā)酵液處理方法：將發(fā)酵液裝入旋轉蒸發(fā)儀中，50 ℃旋轉蒸發(fā)至干，加入5 mL甲醇（色譜純）溶解，超聲波30 min助溶，靜置24 h后用0.45 μm油性纖維濾膜過濾2～3次。

1.2.3 HPLC色譜條件 C18柱（直徑15 cm×4 mm ID），檢測波長360 nm，流速0.8 mL/min，柱溫55 ℃，流動相甲醇、水體積比為4∶6，進樣體積10 μL。

1.2.4 標準曲線的繪制 將喜樹堿標準液的濃度分別稀釋成0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL。10-羥基喜樹堿標準液的濃度稀釋成：0.002 5、0.003 0、0.003 5、0.004 0、0.004 5 mg/mL。按照“1.2.3”的色譜條件進樣測定，每個濃度重復3次，取峰面積平均值，得出峰面積（y）與濃度（x）的線性回歸方程。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿菌株的初篩結果

分別對內生真菌的發(fā)酵液和菌絲體提取液進行處理，采用TLC法初步篩選發(fā)現(xiàn)，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的內生真菌發(fā)酵液和菌絲體不含喜樹堿或10-羥基喜樹堿；用喜樹種子煎汁培養(yǎng)基培養(yǎng)的內生真菌，其發(fā)酵液不含喜樹堿或10-羥基喜樹堿，但在菌絲體提取液中發(fā)現(xiàn)有3株內生真菌的檢測斑點與喜樹堿標準品的斑點相對應（標準品Rf=0.80，樣品Rf值分別是0.79、0.82、0.82），這3株菌分別是QZ04、CY02和XY09，見圖1；并且還發(fā)現(xiàn)有1株編號為XY05的內生真菌的檢測斑點與10-羥基喜樹堿標準品的斑點相對應（標準品Rf=0.60，樣品Rf=0.62），見圖2。初步判斷為是產(chǎn)活性產(chǎn)物的菌株，并對其進行了形態(tài)學和分子生物學的鑒定，還需用HPLC法再進行定性定量的檢測。

2.2 產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿菌株的定性分析

2.2.1 標準品的HPLC圖 標準品的HPLC圖譜見圖3。喜樹堿標準品保留時間為12.732 min，峰面積為965.212 mAU；10-羥基喜樹堿標品保留時間為7.293 min，峰面積為1 805.47 mAU。

2.2.2 樣品的HPLC圖 產(chǎn)喜樹堿菌株提取物的HPLC圖譜見圖4。產(chǎn)10-羥基喜樹堿菌株提取物的HPLC圖譜見圖5。

比較標準品與4個樣品的HPLC檢測峰圖，發(fā)現(xiàn)4個樣品均有與標準品相似的保留時間（表1、表2）。綜合試驗結果可以判斷樣品中確實含有喜樹堿及其類似物。

2.2.3 菌株中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的含量測定 通過繪制標準曲線，可以較準確地計算出內生真菌產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的含量。喜樹堿和10-羥基喜樹堿標準曲線分別見圖6、圖7。

建立回歸方程，喜樹堿：y=19 058x-0.4913（r=0.999 8）；10-羥基喜樹堿：y=35 357x+0.144 1（r=0.999 7）。將所測樣品的峰面積代入回歸方程計算濃度，再換算出QZ04內生真菌喜樹堿產(chǎn)量為0.029 mg/g，CY02為0.024 mg/g，XY09為0.037 mg/g；XY05 10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量為0.017 mg/g。

3 小結與討論

1）試驗采用TLC法和HPLC法從151株內生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學和分子生物學的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內生真菌與宿主植物在長期的適應進化過程中，也可能會使內生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗采用了喜樹種子煎汁作為誘導物進行誘導培養(yǎng)，并作了對照試驗，即使用不加誘導物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)，未加誘導物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進一步確定喜樹堿是由內生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗還同時檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結果未檢測出。表明了這4株喜樹內生真菌確實是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子?？赡芤驗槿~子和種子內喜樹堿的高含量，才使得該部位的內生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因為受到喜樹葉子和種子自身內生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進一步的研究。

4）試驗加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導物進行發(fā)酵，較劉蘊哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點：第一，不同種類的內生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進一步的篩選；第二，所加入的誘導物太多或太少都不利于內生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內生真菌的生長[8]。誘導物最適量還有待進一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠遠達不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導物外，還可尋找一些真菌代謝調節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術的應用是提高內生真菌活性物質產(chǎn)量的一個有效途徑，利用原生質體融合技術對內生真菌進行遺傳改造，通過原生質體誘變，遺傳轉化，以及基因調控等分子手段也有望解決內生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

參考文獻：

[1] 李 星.喜樹的分布現(xiàn)狀、藥用價值及發(fā)展前景[J].陜西師范大學學報（自然科學版），2004（S2）：169-173.

[2] 李立源，張冬艷，白鳳武. 喜樹堿及其衍生物的研究進展[J].大連民族學院學報，2001，3（4）：17-22.

[3] 郭良棟.內生真菌研究進展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1979.

[5] 巴尼特，沈崇堯.半知菌屬圖解[M].第三版.北京：科學出版社，1977.

[6] 李承森.植物科學進展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.

[7] 劉蘊哲.喜樹生態(tài)系內生真菌的分子鑒定及藥物化學研究[D].貴陽：貴州大學，2006.

[8] 劉文哲，張愛新，REINSCHEID U M.喜樹內生菌與喜樹堿的關系[J].西北植物學報，2003，23（7）：1275-1278.

3 小結與討論

1）試驗采用TLC法和HPLC法從151株內生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學和分子生物學的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內生真菌與宿主植物在長期的適應進化過程中，也可能會使內生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗采用了喜樹種子煎汁作為誘導物進行誘導培養(yǎng)，并作了對照試驗，即使用不加誘導物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)，未加誘導物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進一步確定喜樹堿是由內生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗還同時檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結果未檢測出。表明了這4株喜樹內生真菌確實是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子?？赡芤驗槿~子和種子內喜樹堿的高含量，才使得該部位的內生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因為受到喜樹葉子和種子自身內生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進一步的研究。

4）試驗加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導物進行發(fā)酵，較劉蘊哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點：第一，不同種類的內生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進一步的篩選；第二，所加入的誘導物太多或太少都不利于內生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內生真菌的生長[8]。誘導物最適量還有待進一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠遠達不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導物外，還可尋找一些真菌代謝調節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術的應用是提高內生真菌活性物質產(chǎn)量的一個有效途徑，利用原生質體融合技術對內生真菌進行遺傳改造，通過原生質體誘變，遺傳轉化，以及基因調控等分子手段也有望解決內生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

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3 小結與討論

1）試驗采用TLC法和HPLC法從151株內生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學和分子生物學的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內生真菌與宿主植物在長期的適應進化過程中，也可能會使內生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗采用了喜樹種子煎汁作為誘導物進行誘導培養(yǎng)，并作了對照試驗，即使用不加誘導物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)，未加誘導物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進一步確定喜樹堿是由內生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗還同時檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結果未檢測出。表明了這4株喜樹內生真菌確實是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子?？赡芤驗槿~子和種子內喜樹堿的高含量，才使得該部位的內生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因為受到喜樹葉子和種子自身內生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進一步的研究。

4）試驗加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導物進行發(fā)酵，較劉蘊哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點：第一，不同種類的內生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進一步的篩選；第二，所加入的誘導物太多或太少都不利于內生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內生真菌的生長[8]。誘導物最適量還有待進一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠遠達不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導物外，還可尋找一些真菌代謝調節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術的應用是提高內生真菌活性物質產(chǎn)量的一個有效途徑，利用原生質體融合技術對內生真菌進行遺傳改造，通過原生質體誘變，遺傳轉化，以及基因調控等分子手段也有望解決內生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

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[7] 劉蘊哲.喜樹生態(tài)系內生真菌的分子鑒定及藥物化學研究[D].貴陽：貴州大學，2006.

[8] 劉文哲，張愛新，REINSCHEID U M.喜樹內生菌與喜樹堿的關系[J].西北植物學報，2003，23（7）：1275-1278.