蔡晶晶 孟倩麗 郭?？?張良 李東風 崔穎

血紅素加氧酶-1在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血單個核細胞中的表達△

蔡晶晶 孟倩麗 郭?？?張良 李東風 崔穎

糖尿病視網(wǎng)膜病變；血紅素加氧酶-1；氧化應(yīng)激；基因表達

目的觀察血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)患者外周血單個核細胞(peripheral blood mono-nuclear cell，PBMC)中的表達。方法選擇糖尿病病程大于6個月的2型糖尿病患者共64例，根據(jù)臨床表現(xiàn)和診斷將其分為無糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)組18例及DR組46例，其中DR組中包括非增生型DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)患者24例及增生型DR(proliferative retinopathy,PDR)患者22例。選擇同期行體檢的健康志愿者20人作為對照。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組PBMC中HO-1 mRNA的表達水平，比較各組之間HO-1 mRNA表達水平的差異，并分析HO-1 mRNA表達水平與各項理化指標之間的相關(guān)性。結(jié)果qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，DR組、NDR組以及對照組PBMC中HO-1 mRNA相對表達量分別是0.015±0.007、0.021±0.010、0.027±0.013，差異有統(tǒng)計學意義(F=10.888，P<0.001)。其中，DR組HO-1 mRNA的相對表達量明顯低于NDR組(P=0.014)；NDR組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)；PDR組患者PBMC中HO-1 mRNA相對表達量為 0.012±0.007，顯著低于NPDR組(0.018±0.007)(t=-3.052,P=0.004)。ln(HO-1) mRNA 表達水平與收縮壓(β=-0.011，P=0.001)及糖化血紅蛋白(β=0.088,P=0.008)之間存在顯著相關(guān)性。結(jié)論HO-1 mRNA在DR患者及PDR患者PBMC中的表達顯著降低，提示HO-1可能作為一個保護性因素參與DR的發(fā)生及病情進展。

[眼科新進展，2014，34(1)：37-40]

氧化應(yīng)激機制與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)發(fā)生的關(guān)系逐漸成為近年來研究的熱點。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)一直被認為具有良好的抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細胞凋亡以及抗細胞增殖的功能。有研究發(fā)現(xiàn)HO-1在高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細胞以及糖尿病動物模型的視網(wǎng)膜上存在異常表達[1-2]。Da等[3]分離供體眼球的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者HO-1 mRNA表達低于正常組及高血壓組，但是其在DR患者中的表達情況尚不清楚。因此，為了探討HO-1在DR發(fā)病機制中的作用，本研究觀察了HO-1在2型糖尿病患者外周血單個核細胞(peripheral blood mono-nuclear cell，PBMC)中的表達，以期為闡明DR的發(fā)病機制、尋求新的治療靶點提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料將2011年11月至2012年12月在廣東省人民醫(yī)院眼科和內(nèi)分泌科住院治療的64例2型糖尿病患者納入本研究，其糖尿病病程均大于6個月。所有受試者通過實驗室檢查排除嚴重心血管疾病、外周動脈粥樣硬化、肝腎及腫瘤疾病，以及近期無急性感染病史。所有患者簽署知情同意書后均進行了視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡眼前節(jié)、前置鏡眼底檢查，糖尿病患者中眼底分期難以區(qū)分的患者還進行了眼底熒光血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA)檢查。綜合前置鏡眼底檢查、眼底彩色照相以及FFA檢查結(jié)果，根據(jù)國際DR嚴重程度分級標準[4]，將64例2型糖尿病患者分為糖尿病無視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)組(18例)、DR組(46例)。其中DR組中包括非增生型DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)患者24例，眼底主要表現(xiàn)為微血管瘤、出血、滲出、視網(wǎng)膜水腫等體征；增生型DR(proliferative retinopathy，PDR)患者22例，眼底主要表現(xiàn)為視盤新生血管、玻璃體積血或合并纖維增殖膜、視網(wǎng)膜脫離等。對照組為年齡大于40歲，且血壓、血糖和血脂均正常的20名同期參加體檢的健康志愿者。

1.2方法

1.2.1體檢和生化檢查空腹30 min，靜息15 min后，采用電子血壓儀測量受試者坐位時上臂血壓。禁食10 h后第2天清晨采空腹靜脈血，測定血常規(guī)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、血肌酐。對于糖尿病患者，采用離子交換高效液相色譜分析法測量糖化血紅蛋白(HbA1c)含量。

1.2.2PBMC總RNA提取按照常規(guī)方法，取新鮮外周血2 mL入EDTA試管，應(yīng)用淋巴細胞分離液(TBD公司，中國)分離PBMC，用Trizol抽提液(TAKARA公司,日本)提取總RNA，測定其260 nm和280 nm的吸收率，計算純度和含量。比值在1.8～2.0者作為合格標本進行逆轉(zhuǎn)錄試驗。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，日本)。采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。HO-1上游引物為：5’-CTTCTTCACCTTCCCCAACA-3’，下游引物為：5’-GCTCTGGTCCTTGGTGTCAT-3’；產(chǎn)物長度為193 bp。β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參；β-actin上游引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物為：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，產(chǎn)物長度為250 bp?？偡磻?yīng)體系為10 μL，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液2 μL，總RNA濃度為500 μg·L-1，另加無RNA酶水定容至10 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃下將cDNA按總反應(yīng)體系10 μL配制，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒進行反應(yīng)。其中cDNA 1 μL，滅菌蒸餾水3.2 μL，qRT-PCR上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，2倍Taq聚合酶染料反應(yīng)緩沖液5.0 μL。混勻放入熒光定量PCR儀器里。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。所有樣本均采用三復(fù)孔進行試驗。反應(yīng)結(jié)束后電腦自動繪出各自的標準曲線，以熔解曲線為單一峰形、出峰位置為退火溫度代表產(chǎn)物特異性好。由軟件自動計算出待測樣品中目的基因和管家基因的準確含量。使用相對表達量作為評價目的基因表達水平的指標，相對表達量為2-ΔCt，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因，Ct為熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的臨界循環(huán)數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1一般結(jié)果NDR組、NPDR組、PDR組、對照組性別、收縮壓、舒張壓、高血壓病史、現(xiàn)階段胰島素使用史、AST和ALT比較，差異均無統(tǒng)計學意義。各組中的年齡、糖尿病病程、HbA1c、血肌酐比較，差異均有統(tǒng)計學意義。NDR組、NPDR組及PDR組進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，PDR組年齡為(51.5±8.0)歲，顯著小于NDR組的(61.3±12.0)歲及NPDR組的(66.9±9.0)歲(P=0.021、0.001)；NDR組及PDR組糖尿病病程明顯低于NPDR組；PDR組的HbA1c值為(7.6±1.7)%，明顯低于NDR組的(9.3±2.2)%及NPDR組的(9.5±2.6)%(P=0.005、0.002)，而該組的血肌酐水平為(191±179)μmol·L-1，明顯高于NDR組的(69±18)μmol·L-1及NPDR組的(68±18)μmol·L-1(P=0.004、0.005)。

2.2HO-1mRNA的表達qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HO-1獲得理想的單一峰形熔解曲線，其擴增產(chǎn)物的特異性好(圖1)。DR組、NDR組以及對照組PBMC中HO-1 mRNA相對表達量分別為0.015±0.007、0.021±0.010、0.027±0.013，差異有統(tǒng)計學意義(F=10.888,P<0.001)。其中，DR組HO-1 mRNA的相對表達量明顯低于NDR組(P=0.014)，NDR組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)。進一步對DR組中NPDR患者和PDR患者分析顯示，PDR組患者PBMC中HO-1 mRNA相對表達量為0.012±0.007，顯著低于NPDR組(0.018±0.007),差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=-3.052,P=0.004)。

Figure 1 Dissociation curve of HO-1 and β-actin.A:HO-1;B:β-actin HO-1、β-actin熔解曲線圖。A：HO-1熔解曲線；B：β-actin熔解曲線

2.3DR患者HO-1mRNA表達的相關(guān)因素分析將HO-1 mRNA表達量進行l(wèi)n(HO-1)正態(tài)轉(zhuǎn)換，相關(guān)分析結(jié)果顯示，ln(HO-1)與收縮壓(r=-0.357，P=0.009)、HbA1c (r=0.263,P=0.046)存在顯著相關(guān)(圖2)。多重線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，ln(HO-1)(Y)與收縮壓(X1)(β=-0.011，P=0.001)及HbA1c(X2)(β=0.088，P=0.008)獨立相關(guān)，回歸方程為Y=-3.416-0.011X1+0.088X2。

Figure 2 Correlation between expression of ln(HO-1) mRNA and systolic pressure,clucosylated hemoglobin ln(HO-1)mRNA表達與收縮壓及HbA1c的相關(guān)分析

3 討論

DR屬于糖尿病微血管并發(fā)癥之一，嚴重者可以致盲。大量的研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)對DR的發(fā)展，尤其是對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞功能的失調(diào)及死亡具有重要作用[5]。既往研究證實，在體外細胞培養(yǎng)及動物模型中，HO-1在RPE細胞、內(nèi)皮細胞、光感受器細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、Müller細胞中均有表達，在應(yīng)激狀態(tài)下其表達增高[2,6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1能夠通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、抗增殖效應(yīng)來保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的功能。HO-1表達的升高與Nrf2/ERK信號通路激活有關(guān)，還可能與調(diào)控誘導(dǎo)超氧化物歧化酶-1的表達，以及抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α、P53、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平相關(guān)[9]。對糖尿病小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在病程早期，HO-1在視網(wǎng)膜組織中的表達升高，但是隨著病情的進展，HO-1的表達降低，進而導(dǎo)致抗氧化應(yīng)激作用降低[1]。

本研究證實，DR患者的HO-1 mRNA的相對表達量明顯低于未發(fā)生視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者，提示HO-1表達水平的降低可能是導(dǎo)致DR發(fā)生的原因之一。本研究對DR患者的進一步分析發(fā)現(xiàn)，PDR患者PBMC中HO-1 mRNA表達含量明顯低于NPDR患者，提示HO-1可能參與了DR的病情進展，其表達水平的降低可能加劇了DR的嚴重程度。由此我們推測，外周血PBMC中HO-1的高表達可能對DR的發(fā)生發(fā)展是一個保護因素。

然而Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用轉(zhuǎn)染HO-1 siRNA、原鋅卟啉抑制HO-1活性、缺氧情況下敲除HO-1等方法，均能顯著降低人RPE細胞中VEGF的表達，提示HO-1具有促進新生血管化的作用。因此，為進一步明確HO-1在DR進展中的作用，尚需探討HO-1在DR患者眼局部的表達情況，同時借助糖尿病動物模型以及體外視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)等進一步闡明其作用機制。

本研究對DR患者的基本情況及理化檢查指標進行分析發(fā)現(xiàn)，PDR患者的年齡、糖尿病病程及HbA1c水平均明顯低于NPDR患者。我們推測這可能與高血糖的“代謝記憶”有關(guān)。所謂“代謝記憶”，是指糖尿病患者的高血糖水平如果在發(fā)病早期不能得到及時控制，即使后期持續(xù)穩(wěn)定在正常水平，DR等慢性并發(fā)癥仍然會繼續(xù)發(fā)展，難以逆轉(zhuǎn)。炎癥因子瀑布、氧化應(yīng)激增強以及表觀遺傳修飾的變化等在高血糖“代謝記憶”現(xiàn)象發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。此外，糖尿病患者年齡較小[12]、空腹血糖波動[13]等均可導(dǎo)致PDR的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病與DR均是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，二者之間存在著共同的發(fā)病機制，如遺傳因素、糖基化終末產(chǎn)物、多元醇通路、蛋白激酶C激活、細胞因子、免疫炎癥因素等[14]。因此，有研究證實二者在臨床中可以相互評估[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者血肌酐含量顯著高于NPDR患者及未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者，提示PDR的發(fā)生與腎臟的損害可能存在更加密切的關(guān)系。此外，我們發(fā)現(xiàn)DR患者外周血HO-1 mRNA的表達與收縮壓具有相關(guān)性，這可能與HO-1通過調(diào)節(jié)血管功能和腎臟功能進而參與血管減壓調(diào)節(jié)的作用有關(guān)[17]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病病程大于6個月的2型糖尿病患者中，其PBMC中HO-1 mRNA的表達顯著低于未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者，其在PDR患者中的表達明顯低于NPDR患者，提示了HO-1表達水平的降低可能是導(dǎo)致DR發(fā)生發(fā)展的原因之一，而增加HO-1的含量可能是治療DR的新途徑。

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date：Oct 18,2013

National Natural Science Foundation of China(No：81371031)；Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province(No：B2011013)；Science and Technology Star of Zhujiang of Guangzhou City(No：2011J2200050)From theSouthernMedicalUniversity(CAI Jing-Jing),Guangzhou510080,GuangdongProvince，China；DepartmentofOphthalmology,GuangdongGeneralHospital,GuangdongEyeInstitute,GuangdongAcademyofMedicalSciences(CAI Jing-Jing，MENG Qian-Li,GUO Hai-Ke,ZHANG Liang，CUI Ying),Guangzhou510080,GuangdongProvince，China；GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences(LI Dong-Feng),Guangzhou510080,GuangdongProvince，China

Expression of heme oxygenase-1 in peripheral blood mono-nuclear cells of diabetic retino pathy patients

CAI Jing-Jing,MENG Qian-Li,GUO Hai-Ke,ZHANG Liang,LI Dong-Feng,CUI Ying

diabetic retinopathy;heme oxygenase-1;oxidative stress;gene expression

Objective To observe the expression of heme oxygenase-1(HO-1) in peripheral blood mono-nuclear cells (PBMC) of patients with diabetic retinopathy (DR).Methods All of the durations of the diabetes courses were greater than 6 months.Eighteen patients with non-diabetic retinopathy (NDR group),46 patients with DR (DR group) and 20 healthy controls (control group) were included in this study.There were 24 patients with non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and 22 patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR).Peripheral blood samples were obtained from all recruitments.HO-1 mRNA was analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR).The correlation between the expression of HO-1 and some physical parameters was also analyzed.Results The results of qRT-PCR showed that the relative expressions of HO-1 mRNA in DR group,NDR group and control group were 0.015±0.007,0.021±0.010 and 0.027±0.013,there was statistical difference(F=10.888,P<0.001).The expression of HO-1 mRNA in DR group was significantly lower than those in the NDR group(P=0.014).There was no significant difference in HO-1 mRNA between NDR group and control group(P=0.125).Compared with NPDR group (0.018±0.007),the relative expression of HO-1 mRNA was significantly lower in PDR group (0.012±0.007)(t=-3.052,P=0.004).There was a correlation between expression of ln(HO-1) mRNA and systolic pressure(β=-0.011,P=0.001),as well as clucosylated hemoglobin (β=0.088,P=0.008).Conclusion HO-1 mRNA expression is decreased in DR and PDR patients compared with the controls,indicating that HO-1 may play a protective role in DR development.

蔡晶晶，女，1989年1月出生，碩士。聯(lián)系電話：15521116233；E-mail:baobao3489@sina.com

AboutCAIJing-Jing:Female,born in January,1989.Master degree.Tel:15521116233；E-mail:baobao 3489@sina.com

2013-10-18

國家自然科學基金資助(編號：81371031)；廣東省醫(yī)學科研基金資助(編號：B2011013)；廣州市珠江科技新星專項基金資助(編號：2011J2200050)

510080 廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(蔡晶晶)；510080 廣東省廣州市，廣東省眼病防治研究所，廣東省人民醫(yī)院眼科，廣東省醫(yī)學科學院(蔡晶晶，孟倩麗，郭?？疲瑥埩?，崔穎)；510080 廣東省廣州市，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究部(李東風)

郭?？疲珽-mail:guohaike@medmail.com.cn

蔡晶晶,孟倩麗,郭?？?張良,李東風,崔穎.血紅素加氧酶-1在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血單個核細胞中的表達[J].眼科新進展,2014,34(1):37-40.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0010

修回日期：2013-11-04

本文編輯：方紅玲

Accepteddate:Nov 4，2013

Responsibleauthor:GUO Hai-Ke,E-mail:guohaike@medmail.com.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(1):37-40]