李琴 謝婷玉 陳雪藝 王清 郭喬茜 具爾提·哈第爾

臭氧灌腸改善糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜電圖表現(xiàn)

李琴 謝婷玉 陳雪藝 王清 郭喬茜 具爾提·哈第爾

臭氧；糖尿病視網(wǎng)膜病變；視網(wǎng)膜電圖；大鼠

目的觀察臭氧灌腸對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜電圖的影響。方法取18只正常大鼠為正常對(duì)照組(N組)，另54只以鏈脲佐菌素(STZ)造模成功的糖尿病大鼠分為臭氧治療組(A組)、氧氣治療組(B組)、模型對(duì)照組(C組)，每組18只于造模成功后6周將A組大鼠行臭氧灌腸，每周3次，以同樣頻率和劑量將B組行純氧灌腸，其余兩組不干預(yù)，1個(gè)月后應(yīng)用閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢測(cè)視網(wǎng)膜功能。結(jié)果用單因素方差分析4組大鼠暗適應(yīng)及明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖a波、b波振幅及潛伏期差異。暗適應(yīng)a波及b波振幅：與N組[a波：(39.61±1.30)μV；b波：(99.45±2.77)μV]相比，B組[a波:(10.44±0.97)μV;b波:(32.91±2.61)μV]和C組[a波:(10.72±1.06)μV；b波:(33.43±2.76)μV]均明顯下降，而A組[a波：(18.68±0.92)μV；b波：(46.86±2.53)]下降不明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。暗適應(yīng)a波潛伏期B組為(30.10±2.42)ms，C組為(30.30±2.58)ms，均較N組的(13.44±2.55)ms延長(zhǎng)，A組為(19.81±2.71)ms，較N組延長(zhǎng)不明顯，但差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；暗適應(yīng)b波潛伏期A組為(42.91±4.72)ms，與C組的(54.60±2.27)ms和B組的(53.40±4.97)ms相比較略縮短，但其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。明適應(yīng)a波振幅各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.28，P>0.05)；而明適應(yīng)b波振幅B組為(15.01±0.87)μV，C組為(14.18±0.79)μV，均較N組的(25.41±1.25)μV下降，A組為(21.82±0.78)μV，較N組下降不明顯，但差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；a波潛伏期A組為(15.72±1.90)ms，與B組的(15.40±2.01)ms及C組的(15.30±1.63)ms相比，均略延長(zhǎng)，三組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；b波潛伏期B組為(65.20±1.54)ms，C組為(65.30±1.94)ms，均較N組的(43.00±2.82)ms明顯延長(zhǎng)，A組為(51.63±2.87)ms，較N組延長(zhǎng)不明顯，但差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。結(jié)論糖尿病大鼠病程早期即出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)功能損害，直腸灌注臭氧對(duì)大鼠視網(wǎng)膜功能有一定改善作用。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(1)：34-36]

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。目前我國(guó)DR致盲率仍呈上升趨勢(shì)[1]。DR嚴(yán)重程度與糖尿病病程密切相關(guān)，因此，早期發(fā)現(xiàn)及治療尤為重要。在早期DR的防治中,除控制血糖、血壓等危險(xiǎn)因素外,有針對(duì)性的藥物治療受到了重視。臭氧(O3)是一種強(qiáng)氧化劑，醫(yī)用臭氧自1935年首次應(yīng)用于臨床以來(lái)，越來(lái)越廣泛地運(yùn)用于多種疾病的預(yù)防及治療，并得到認(rèn)可[2]。目前尚沒(méi)有其對(duì)DR的研究報(bào)道，因此本研究通過(guò)建立大鼠DR模型,觀察臭氧治療對(duì)早期DR視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)的影響,探討O3對(duì)早期DR的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SD大鼠(清潔級(jí))72只，體質(zhì)量300 g左右，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。嚴(yán)格按照ARVO關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，美國(guó)Sigma公司)；SumStep血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；HealOzone臭氧發(fā)生儀(德國(guó)卡瓦公司)；羅蘭電生理系統(tǒng)(高視遠(yuǎn)望公司)。

1.2方法

1.2.1STZ制造大鼠糖尿病模型72只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1個(gè)月,隨機(jī)數(shù)字表法抽取54只大鼠以自制高脂高糖飼料喂養(yǎng),每周測(cè)體質(zhì)量,監(jiān)測(cè)血糖。6周后禁食不禁水12 h,以30 mg·kg-1新鮮配置STZ(以0.1 mmol·L-1,pH 4.3～4.5的檸檬酸鹽緩沖液稀釋) 快速一次性左下腹腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,給藥后24 h及1周時(shí)分別斷尾取血測(cè)血糖,兩次血糖均>16.7 mmol·L-1者視為糖尿病模型造模成功(共得到糖尿病大鼠54只)，為提高動(dòng)物模型的穩(wěn)定性，成模后大鼠再高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，后改為普通飼料喂養(yǎng)并將這些大鼠隨機(jī)分為臭氧治療組(A組)、氧氣治療組(B組)、模型對(duì)照組(C組)各18只，正常對(duì)照組(N組)大鼠給予持續(xù)普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.2O3與O2混合氣制備與干預(yù)以O(shè)3發(fā)生儀制備醫(yī)用O3(O3與O2的混合氣)，設(shè)定O3濃度為50 mg·L-1,對(duì)A組大鼠進(jìn)行醫(yī)用O3直腸灌注，每周3次，灌注劑量以50 μg·kg-1計(jì)算[3-4]，B組大鼠以同樣頻率及濃度進(jìn)行純O2直腸灌注，以1個(gè)月為1療程，C組及N組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.2.3O3灌腸方法大鼠排空直腸后，1 mL注射器(管徑與大鼠直腸相仿)插入大鼠直腸深度約4 cm緩慢灌入，按壓肛門5 min，防止氣體泄出。氧氣灌腸方法同O3灌腸，氣體體積換算至與O3等量。

1.2.4ERG檢測(cè)方法

1.2.4.1檢測(cè)步驟大鼠麻醉后,以自制包布包裹大鼠身體進(jìn)行保暖；暗適應(yīng)60 min后，復(fù)方托吡卡胺滴眼液(美多麗滴眼液)滴被檢眼充分散瞳；于被檢眼同側(cè)頰囊皮下置參考電極,尾部皮下置針狀接地電極,大鼠眼表面滴卡波姆眼用凝膠保護(hù)角膜，將金絲環(huán)形電極安置于被檢眼角膜上，保持電極持續(xù)穩(wěn)定接觸角膜，各電極阻抗控制在10 Ω以內(nèi)(弱紅光下安置電極，由同一人操作以減小操作引起的誤差)；以RETI-port系統(tǒng)行ERG檢測(cè)。

1.2.4.2設(shè)備參數(shù)F-ERG為白色閃光刺激,閃光強(qiáng)度為3.0 cd·s-1·m-2,閃光間隔為15 s。通頻帶0.1～500.0 Hz,掃描時(shí)間250 ms,疊加次數(shù)4次。閃光強(qiáng)度2.398 cd·s-1·m-2,閃光間隔為15 s,通頻帶100～500 Hz,掃描時(shí)間250 ms,疊加次數(shù)8次。

1.2.4.3測(cè)量指標(biāo)測(cè)量F-ERG 暗適應(yīng)a、b波峰值潛伏期及振幅,明適應(yīng)a、b波峰值潛伏期及振幅。a波峰值潛伏期為刺激開(kāi)始到a波波谷的時(shí)間,振幅為基線到波谷的電位值;b波峰值潛伏期為刺激開(kāi)始到b波波峰的時(shí)間,振幅為a波波谷到b波波峰的電位值。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)4組ERG a波、b波潛伏期和振幅的比較在統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0下進(jìn)行計(jì)量資料方差分析及多組均數(shù)間兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠暗適應(yīng)ERGa波及b波的振幅及潛伏期四組間a波、b波的振幅比較及a波、b波潛伏期比較見(jiàn)表1，B組、C組較N組a波、b波的振幅均下降，A組a波、b波的振幅下降不明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),而B(niǎo)組與C組比較振幅無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；b波潛伏期A組與B組及C組比較略縮短，但其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，B組、C組較N組a波潛伏期均延長(zhǎng)，A組a波潛伏期延長(zhǎng)不明顯，但差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.2各組大鼠明適應(yīng)ERGa波及b波的振幅及潛伏期四組間a波及b波的振幅比較及a波潛伏期比較見(jiàn)表2，四組間a波振幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組及C組較N組b波振幅均明顯下降，A組下降不明顯，且明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而B(niǎo)組與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A組、B組及C組a波潛伏期均略延長(zhǎng)，三組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組、C組較N組b波潛伏期明顯延長(zhǎng)，A組潛伏期延長(zhǎng)不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組閃光視網(wǎng)膜電圖暗適應(yīng)時(shí)a波及b波的振幅及潛伏期比較Table 1 Comparison of amplitudes and latencies of a-wave and b-wave in dark adaption of each group (±s)

表2 各組閃光視網(wǎng)膜電圖明適應(yīng)時(shí)a波及b波的振幅及潛伏期比較Table 2 Comparison of amplitudes and latencies of a-wave and b-wave in bright adaption of each group (±s)

3 討論

DR通常被認(rèn)為是一種以視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病理變化所致的疾病，但近年來(lái)的很多研究都支持糖尿病早期就發(fā)生了視神經(jīng)損害這一觀點(diǎn)[5-6]。DR的發(fā)展主要是視網(wǎng)膜缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，使正常的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，繼而發(fā)生視網(wǎng)膜血管出血、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變等一系列不可逆轉(zhuǎn)的致盲性改變。ERG的a波起源于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層,是一種超極化動(dòng)作電位,反映感光細(xì)胞的生物電活動(dòng)；ERG的b波起源于視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞，其變化反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞(主要是雙極細(xì)胞)的電活動(dòng),在視網(wǎng)膜功能的診斷中是一個(gè)靈敏度及可靠度較高的客觀指標(biāo)[7-8]。本次實(shí)驗(yàn)中，糖尿病大鼠造模成功后6周暗適應(yīng)ERG a波、b波潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng),振幅明顯下降,說(shuō)明在糖尿病早期,視網(wǎng)膜神經(jīng)元和(或)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能已發(fā)生改變，這與近年來(lái)關(guān)于糖尿病早期就存在視神經(jīng)損害的研究結(jié)果相一致[8]。ERG暗適應(yīng)O3治療組較對(duì)照組振幅降低，潛伏期延長(zhǎng)，但與氧氣治療組及模型對(duì)照組相比，其振幅降低及潛伏期延長(zhǎng)的幅度均不明顯，這說(shuō)明O3灌腸治療后能夠改善DR引起的ERG a波、b波振幅下降及潛伏期延長(zhǎng)。明適應(yīng)ERG b波振幅及潛伏期O3治療組亦有向正常對(duì)照組靠攏的趨勢(shì)，說(shuō)明O3灌腸治療后能夠改善DR引起明適應(yīng)ERG b波振幅下降及潛伏期延長(zhǎng)，而對(duì)a波的影響不明顯。以上均體現(xiàn)了O3治療能夠改善DR大鼠的視網(wǎng)膜功能。O3作用于機(jī)體時(shí)能夠增加紅細(xì)胞糖酵解速率，從而導(dǎo)致2,3-二磷酸甘油酸增多，促進(jìn)氧的合成，進(jìn)而使釋放入組織的氧增加；還能夠通過(guò)增強(qiáng)丙酮酸的氧化羧化作用來(lái)激活克雷布斯循環(huán),刺激產(chǎn)生ATP；它還導(dǎo)致NADH顯著減少并且有助于氧化細(xì)胞色素c，并刺激一系列作為自由基的清道夫的酶類，這些酶類可降解自由基；此外，O3還能夠使前列腺素生成增多[9-11]，擴(kuò)張血管，改善循環(huán)。O3治療可能通過(guò)以上機(jī)制的綜合作用改善血液流變學(xué)，使組織攜氧能力增強(qiáng)，從而降低了視網(wǎng)膜組織病理改變的程度，繼而改善了以ERG為代表的視網(wǎng)膜功能。

本研究結(jié)果顯示,O3可能對(duì)DR大鼠具有一定視神經(jīng)保護(hù)作用，但O3對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)功能保護(hù)作用的具體機(jī)制，以及O3治療以何種給藥方式、給藥濃度進(jìn)行治療能夠達(dá)到最優(yōu)的效果等還需進(jìn)一步研究。

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date：Aug 26,2013

ERG features in diabetic rats after ozone coloclysis

LI Qin,XIE Ting-Yu,CHEN Xue-Yi,WANG Qing,GUO Qiao-Qian,JUERTI Hadier

ozone;diabetic retinopathy;electroretinogram;rat

Objective To investigate the electroretinogram (ERG) features in diabetic rats after ozone coloclysis.Methods After experimental diabetic models were induced successfully with streptozotoein,54 diabetic rats were averagely divided into 3 groups at random,which including ozone treatment group (group A),pure oxygen treatment group (group B) and diabetic control group (group C).Furthermore,18 healthy rats were chosen as normal control group (group N).After 6 weeks of adapted feeding,group A was given the ozone coloclysis,3 times a week,and at the same time,group B was given pure oxygen,and the other two groups with no intervention.Period of treatment was one mouth.The ERG features including amplitudes and latencies of a-wave and b-wave were analyzed.Results The differences of amplitudes and latencies of a-wave and b-wave in dark and bright adaption were analyzed by one-way ANOVA.Amplitudes of a-wave and b-wave in dark adaption of group B [(10.44±0.97)μV,(32.91±2.61)μV],group C [(10.72±1.06)μV,(33.43±2.76)μV] were both lower than those of group N [(39.61±1.30)μV,(99.45±2.77)μV],and group A [(18.68±0.92)μV,(46.86±2.53)μV] decreased no obviously,there were statistical differences (allP<0.05).Latencies of a-wave in dark adaption of group B [(30.10±2.42)ms],group C [(30.30±2.58)ms] were longer than those of group N [(13.44±2.55)ms,group B (19.81±2.71)ms] extended no obviously,there were statistical differences (allP<0.05).Latencies of b-wave in dark adaption of group A [(42.91±4.72)ms] was slightly shorter than those of group C [(54.60±2.27)ms] and group B [(53.40±4.97)ms],but there was no statistical difference(P>0.05).In bright adaption,there was no statistical difference in the amplitudes of a-wave (F=0.28,P>0.05)；Amplitude of b-wave of group B [(15.01±0.87)μV],group C [(14.18±0.79)μV] was lower than those of group N [(25.41±1.25)μV],group A [(21.82±0.78)μV] decreased no obviously,there was statistical difference (P<0.05);Latencies of a-wave of group A [(15.72±1.90)ms],group B[(15.40±2.01)ms] and group C [(15.30±1.63)ms] were all slightly extended,but there was no statistical difference for any two groups(allP>0.05);Latencies of b-wave of group B [(65.20±1.54)ms],group C [(65.30±1.94)ms] were obviously extended than those of group N [(43.00±2.82)ms],group A extended slightly[(51.63±2.87)ms],there were statistical differences(allP<0.05).Conclusion Functional damages of retinal nerve are appeared in the early stages in diabetic rats,and ozone coloclysis may show protective effects on the nerve function in diabetic retina.

李琴，女，1988年5月出生，碩士研究生在讀。聯(lián)系電話：0991-4361200；E-mail:amanda_513@126.com

AboutLIQin:Female,born in May,1988.Postgraduate student.Tel:+86-991-4361200;E-mail:amanda_513@126.com

2013-08-26

830054 新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科

具爾提·哈第爾，E-mail:juret.foreye@yahoo.com.cn

李琴,謝婷玉,陳雪藝,王清,郭喬茜,具爾提·哈第爾.臭氧灌腸改善糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜電圖表現(xiàn)[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(1):34-36.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0009

修回日期：2013-10-21

本文編輯：董建軍

Accepteddate:Oct 21,2013

From theDepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalCollege,Urumqi830054,XinjiangUygurAutonomousRegion,China

Responsibleauthor:JUERTI Ha dier，E-mail:juret.foreye@yahoo.com.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(1):34-36]