賴偉霞 梁皓 譚少健 李霞 鄒文進(jìn) 蔣林志

鈣調(diào)素在正常人及不同年齡白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)△

賴偉霞 梁皓 譚少健 李霞 鄒文進(jìn) 蔣林志

鈣調(diào)素；白內(nèi)障；晶狀體上皮細(xì)胞；免疫熒光

目的檢測鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)在正常人及不同年齡白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LEC)中的表達(dá)情況，探討CaM與白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其表達(dá)在白內(nèi)障患者中是否有年齡相關(guān)性。方法收集18～28歲角膜移植患者的正常晶狀體前囊膜12例，1～18歲(兒童組)、>18～45歲(青年組)、>45～60歲(中年組)、>60歲(老年組)白內(nèi)障患者手術(shù)中環(huán)形撕除的晶狀體前囊膜各12例，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片處理，間接免疫熒光方法檢測CaM的表達(dá)量，拍照，IPP 6.0計(jì)算CaM的熒光值，SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果CaM在LEC中有表達(dá)，且主要表達(dá)在細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。同年齡組相比，青年組白內(nèi)障患者LEC中CaM的表達(dá)量(0.507±0.288)高于正常組(0.297±0.007)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.448，P=0.021)；兒童組(0.624±0.207)、青年組(0.507±0.288)、中年組(0.704±0.168)、老年組(0.561±0.288)白內(nèi)障患者間LEC中CaM的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。結(jié)論CaM在人LEC的表達(dá)與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能是晶狀體損傷白內(nèi)障發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志，CaM在白內(nèi)障LEC中表達(dá)無年齡相關(guān)性。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(1)：10-12]

鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)作為鈣的受體，是真核生物中分布最廣、功能最多的鈣受體蛋白，Ca2+-CaM系統(tǒng)是晶狀體中維持鈣離子穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要系統(tǒng)[1-2]。CaM以Ca2+-CaM的活性形式參與體內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)，同時(shí)參與眼部Ca2+的調(diào)節(jié)，與白內(nèi)障的發(fā)生有一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織切片免疫熒光方法檢測同年齡正常人、白內(nèi)障患者以及不同年齡白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LEC)中CaM的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較，探討CaM與白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及在白內(nèi)障患者中其表達(dá)是否有年齡相關(guān)性，為白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料來源透明晶狀體前囊膜12例(正常組)，來自于2011年9月至2012年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科角膜移植術(shù)供體，其中男8例、女4例，年齡18～28(22.3±2.1)歲；白內(nèi)障晶狀體前囊膜的收集來自于同時(shí)期行白內(nèi)障手術(shù)者，其中1～18歲白內(nèi)障患者(兒童組)的晶狀體前囊膜12例，男6例、女6例，年齡(6.3±3.1)歲；>18～45歲(青年組)12例，男7例、女5例，年齡(38.6±2.2)歲；>45～60歲(中年組)12例，男6例、女6例，年齡(52.6±5.5)歲；>60歲(老年組)12例，男5例、女7例，年齡(67.6±6.2)歲。各組白內(nèi)障患者間年齡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。所有標(biāo)本的取得都經(jīng)患者及其家屬同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會鑒定。

1.2主要試劑及儀器CaM兔抗多克隆抗體(sc-5537)購自于美國Santa Cruz Biotechnology公司。FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(BA1110)、即用型正常山羊封閉血清(AR0009)購自于武漢Boster公司。熒光顯微鏡(日本 OLYMPUS BX53)。

1.3組織固定石蠟切片法收集角膜移植術(shù)供體前囊膜及白內(nèi)障手術(shù)環(huán)形撕囊所獲前囊膜，立即置于40 g·L-1中性多聚甲醛固定，室溫存放12～24 h；梯度酒精脫水，二甲苯透明，每缸15 min；55 ℃浸蠟3 h，包埋；切片，厚度3 μm，55 ℃烤箱烤片4 h，置于切片盒室溫保存。

1.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法將保存的石蠟切片烤片10 min，三缸二甲苯脫蠟，每缸10 min，梯度酒精水化，每缸5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片3遍×3 min，pH 6.0的0.01 mmol·L-1檸檬酸緩沖液(CBS)高壓修復(fù)10 min，待其冷卻，PBS洗片3遍×3 min，正常山羊封閉血清37 ℃封閉45 min，甩去血清，免洗，加一抗(CaM兔抗多克隆抗體，1200稀釋)，4 ℃孵育過夜，第2天復(fù)溫30 min，PBS洗片3遍×3 min，加熒光二抗(FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，1100稀釋)避光37 ℃孵育30 min，避光PBS洗片3遍×3 min，甩干，用甘油-PBS封片。在暗室條件下立即用熒光顯微鏡觀察拍照，每個(gè)組織隨機(jī)選6個(gè)×400視野觀察并拍照，1 h內(nèi)操作完畢。

1.5熒光分析方法用IPP 6.0分析所拍熒光圖片，每個(gè)組織取6張×400圖片，具體操作方法嚴(yán)格按IPP 6.0官方操作指南，按面積計(jì)算CaM的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1CaM的表達(dá)情況CaM表達(dá)于正常人及白內(nèi)障患者的LEC中，主要表達(dá)在細(xì)胞核，細(xì)胞漿也有少量表達(dá)，囊膜吸附少量熒光。各組表達(dá)情況見圖1。

Figure 1 Immunofluorescence figure of CaM in human LEC form normal and different aged cataract groups.A:Normal group;B:Children group;C:Youth group;D:Middle-aged group;D:Senile group 正常及不同年齡組白內(nèi)障患者LEC中CaM的免疫熒光圖，圖中綠色熒光(FITC)即為CaM表達(dá)。A：正常組；B：兒童組；C：青年組；D：中年組；E：老年組

2.2同一年齡段的正常人和白內(nèi)障患者之間及不同年齡組白內(nèi)障患者之間的比較青年組CaM的表達(dá)量為0.507±0.288，高于正常組的0.297±0.007，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.448，P=0.021)。而兒童組(0.624±0.207)、青年組(0.507±0.288)、中年組(0.704±0.168)、老年組(0.561±0.288)白內(nèi)障患者間CaM的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

3 討論

眾所周知，白內(nèi)障的形成與晶狀體內(nèi)的Ca2+紊亂密切相關(guān)[3-4]。晶狀體內(nèi)的低鈣濃度是晶狀體透明的生理基礎(chǔ)，其維持主要依賴鈣-ATP酶的活性調(diào)節(jié)完成，而CaM是細(xì)胞膜上鈣-ATP酶的重要調(diào)節(jié)蛋白[2]。因此，CaM在LEC中表達(dá)量的增加及降低與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系，且其是否存在年齡相關(guān)性，與老年性白內(nèi)障關(guān)系如何，值得我們進(jìn)一步探討，為白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

CaM是1964年美籍華人張槐耀在研究細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，我國學(xué)者于1987年徐州會議定名為CaM[5]。CaM是真核細(xì)胞中普遍存在的鈣受體蛋白，涉及多種信號途徑，在細(xì)胞增殖周期的調(diào)控及維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)中處于中心地位[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)CaM主要在調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、糖原的合成、神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、受精、有絲分裂和微管解聚等方面發(fā)揮生理功能[7]，但其在晶狀體中的生理功能研究較少。

劉曉莉等[8]使用激活磷酸脂酶法測定正常人及白內(nèi)障患者中CaM含量的研究發(fā)現(xiàn)，正常人及白內(nèi)障患者晶狀體CaM含量：上皮>皮質(zhì)>核，與正常牛晶狀體分布一致，白內(nèi)障晶狀體皮質(zhì)、核CaM的含量高于正常人，但兩者LEC中CaM含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。張明志等[9]對兔晶狀體中CaM的定位研究表明，從LEC到核內(nèi)纖維狀細(xì)胞CaM的含量逐漸增加，在上皮細(xì)胞內(nèi)，CaM主要分布于線粒體、微絲和細(xì)胞核中，其他部位散在分布，CaM在高鈣時(shí)可能直接參與蛋白質(zhì)的聚合，引起晶狀體混濁。王曉貞等[1]對大鼠晶狀體的研究表明，CaM的相對活性隨著大鼠年齡增長而下降，硒性白內(nèi)障中CaM的相對活性高于同齡正常晶狀體。各學(xué)者研究表明，CaM與白內(nèi)障的發(fā)生有一定聯(lián)系，但目前在正常人與白內(nèi)障LEC中的定量研究及其表達(dá)是否有年齡相關(guān)性的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，白內(nèi)障患者LEC內(nèi)CaM的表達(dá)量較同齡正常人高，可能機(jī)制是透明晶狀體在受到氧化損傷等多種原因時(shí)，Ca2+-ATP酶受到抑制，細(xì)胞膜對鈣離子通透性增加，鈣離子內(nèi)流增多，Ca2+-CaM系統(tǒng)激活，CaM表達(dá)量增加以刺激細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量增高，通過蛋白激酶使Ca2+-ATP酶磷酸化，Ca2+-ATP酶活性升高，從而將晶狀體細(xì)胞內(nèi)鈣離子排出細(xì)胞，避免細(xì)胞進(jìn)一步遭受氧化損傷[10-12]。這與劉曉莉[8]、王曉貞等[1]的研究結(jié)果相符，CaM的表達(dá)與鈣離子呈正相關(guān)，且白內(nèi)障患者的表達(dá)較正常人高。王曉貞等[1]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠晶狀體中CaM的相對活性隨著大鼠年齡增長而下降，但我們對白內(nèi)障患者分不同年齡段進(jìn)一步研究，結(jié)果表明不同年齡組白內(nèi)障患者LEC內(nèi)CaM的表達(dá)無明顯差異。這可能與研究種屬及實(shí)驗(yàn)方法不同有關(guān)。

總之，白內(nèi)障患者LEC中CaM表達(dá)量明顯高于正常人，說明該蛋白的改變與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系，可能為晶狀體損傷的一個(gè)標(biāo)志，但在白內(nèi)障患者LEC中CaM的表達(dá)未見明顯年齡相關(guān)性。

1 王曉貞，劉奕志，顧雄飛.鈣調(diào)蛋白在大鼠晶狀體生長發(fā)育和白內(nèi)障形成中作用的研究[J].眼科研究,2004,24(3):236-239.

2 Wu Q,Guo D,Bi H,Wang D,Du Y.UVB irradiation-induced dysregulation of plasma membrane calcium ATPase1 and intracellular calcium homeostasis in human lens epithelial cells[J].MolCellBiochem,2013,382(1-2)：263-272.

3 陳鶯.白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制及預(yù)防治療的研究進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展,2005,25(2)：190-193.

5 顧永清.鈣調(diào)素的生理功能[J].生物學(xué)通報(bào),1994,29(10):12-14.

6 劉建英.鈣調(diào)素與細(xì)胞周期[J].國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊,1998,18(4):322-324.

7 Sanderson JJ,Marcantonio J,Duncan G.A human lens model of cortical cataract:Ca2+-induced protein less,vimentin cleavage and opacification[J].InvestOphthalmolVisSci,2000,44(8):2255-2261.

8 劉曉莉，方謙遜，嚴(yán)密，吳兆鋒.正常和老年性白內(nèi)障晶體的鈣調(diào)節(jié)[J].眼科研究，1996,14(1):13-15.

9 張明志，張光毅，趙昇皓，董紅艷，陳世超，趙強(qiáng),等.兔晶狀體中鈣調(diào)素的定位研究[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1990,10(2):143-145.

10 Galvan A,Louis CF.Calcium regulation by lens plasma membrane vesicles[J].ArchBiochemBiophys,1988,264(2):472-481.

11 Bizec JC,Klethi J,Mandel P.Modulation of adenylate cyclase activity in bovine lens epithelial cells[J].OphthalmicRes,1989,21(3):167-174.

12 Louis CF,Mickelson JR,Turnquist J,Hur KC,Johnson R.Regulation of lens cyclic nucleotide metabolism by Ca2+plus calmodulin[J].InvestOphthalmolVisSci,1987,28(5):806-814.

date：Sep 16,2013

National Natural Science Foundation of China(No：81360146)；Guangxi Natural Science Foundation(No：1140003A-29)From theDepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,GuangxiZhuangAutonomousRegion，China

Expression of calmodulin in lens epithelial cells of normal and cataract patients with different age

LAI Wei-Xia,LIANG Hao,TAN Shao-Jian,LI Xia,ZOU Wen-Jin,JIANG Lin-Zhi

calmodulin;cataract;lens epithelial cell;immunofluorescence

Objective To investigate and compare the expression of calmodulin(CaM) in lens epithelial cells (LEC) of normal and cataract patients with different age,and explore the relationship between CaM and cataract,its age related.Methods Twelve normal anterior capsule membranes of lens (18-28 years old) obtained from corneal transplantation donor.And the anterior capsules of cataract from children group (1-18 years old),young group (>18-45 years old),middle-aged group (>45-60 years old) and elderly group (more than 60 years old) were obtained in circular capsulorhexis of cataract surgery.Indirect immunofluorescence method was used to detect the expression of CaM in LEC.IPP 6.0 was used to calculate the average fluorescent values of CaM,and SPSS 16.0 was used in statistical analysis.Results CaM expressed in human LEC,and its expression mainly in the cytoplasm,cell nucleus also had a small amount of expression.Compared with the same age group,expression of CaM in youth cataract group (0.507±0.288) was higher than normal group (0.297±0.007),there was statistical difference (F=17.448,P=0.021).While in the different age cataract groups,the expression among children group (0.624±0.207),youth group (0.507±0.288),middle-aged group (0.704±0.168),elderly group (0.561±0.288) were no significant difference (allP>0.05).Conclusion The expression of CaM in human LEC is related with the development of cataract,which may be a damaged marker of lens,but CaM expression in cataract LEC has no age difference.

賴偉霞，女，1990年3月出生，廣西陸川人，碩士。聯(lián)系電話：0771-5356507；E-mail：niumonv@aliyun.com

AboutLAIWei-Xia：Female,born in March,1990.Master degree.Tel:+86-771-5356507;E-mail：niumonv@aliyun.com

2013-09-16

國家自然科學(xué)基金資助(編號：81360146)；廣西自然科學(xué)基金資助 (編號：桂科攻1140003A-29)

530021 廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科

梁皓,E-mail:13617712 201@163.com

賴偉霞,梁皓,譚少健,李霞,鄒文進(jìn),蔣林志.鈣調(diào)素在正常人及不同年齡白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(1):10-12.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0003

修回日期：2013-11-07

本文編輯：方紅玲

Accepteddate:Nov 7,2013

Responsibleauthor:LIANG Hao,E-mail:13617712201@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(1):10-12]