張彩喬 耿風(fēng)廷

（華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，河北 石家莊 050000）

0 概述

蛋白質(zhì)的分離純化在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物化學(xué)等方面使用廣泛，是一項(xiàng)關(guān)鍵核心技術(shù)。尤其是隨著生物制藥的迅猛發(fā)展，蛋白質(zhì)作為藥品中的一部分應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而作為藥品，如何將目的蛋白進(jìn)行分離提純就顯得尤為重要。

每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異。蛋白質(zhì)分離提純就是利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)?，F(xiàn)在生物制藥研究中，尤其是大規(guī)模生物制藥生產(chǎn)上，蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)主要應(yīng)用各項(xiàng)層析技術(shù)，其中包括親和層析、離子交換層析、反相層析、疏水層析、分子篩層析等等。

1 親和層析

在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)分離純化方法。

將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過(guò)層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒(méi)有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

2 離子交換層析

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。

離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陽(yáng)離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陰離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH 條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH 值洗脫下來(lái)。

3 反相層析

在吸附層析中，高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢，洗脫時(shí)發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，洗脫液用極性強(qiáng)的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強(qiáng)的物質(zhì)不被吸附，最先洗下來(lái)，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。

4 疏水層析

疏水層析和反相層析（reversed phase chromatography）分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是一致的，利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，蛋白質(zhì)表面一般有疏水與親水集團(tuán)，疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結(jié)合。在洗脫時(shí)，將鹽濃度逐漸降低，因其疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。

一般而言，離子強(qiáng)度（鹽濃度）越高，物質(zhì)所形成的疏水鍵越強(qiáng)。影響疏水作用的因素包括：鹽濃度，溫度，pH，表面活化劑和有機(jī)溶劑。疏水層析的應(yīng)用與離子交換層析的應(yīng)用剛好互補(bǔ)，因此，可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質(zhì)。

5 分子篩層析

分子篩層析又稱為凝膠層析或凝膠過(guò)濾。分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，.對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等，其中以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣。

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動(dòng)，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的。

6 蛋白分離純化過(guò)程中的注意事項(xiàng)

由于蛋白質(zhì)只有在其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)下才具有活性，才能具備相應(yīng)的功能。因此，在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化的時(shí)候，都要時(shí)刻注意維護(hù)它的穩(wěn)定性，保護(hù)它的活性，無(wú)論進(jìn)行何種層析，都需要注意以下方面：

1）生產(chǎn)過(guò)程中考慮操作溫度，尤其是目的蛋白穩(wěn)定性較差的樣品，最好置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行操作；即使是對(duì)溫度不敏感的樣品，也應(yīng)控制操作溫度不超過(guò)室溫，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白緩慢變性。

2）樣品濃度要控制在一定范圍內(nèi)，蛋白濃度維持在μg/mL～mg/mL。

3）選用合適pH 的緩沖液，所使用的緩沖溶液pH 避免與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同，防止蛋白質(zhì)的沉淀。

4）避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動(dòng)，以防蛋白質(zhì)的變性。

5）純化用緩沖溶液的溫度盡量控制穩(wěn)定，溫度過(guò)低則容易導(dǎo)致層析過(guò)程中產(chǎn)生氣泡，溫度過(guò)高則容易使蛋白質(zhì)變性。

6）盡量保證各步分離純化過(guò)程緊密相連，減少樣品放置時(shí)間，因純化過(guò)程為非無(wú)菌過(guò)程，如拖延時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致樣品中菌量增加，進(jìn)而導(dǎo)致樣品內(nèi)毒素水平急劇升高。

7 展望

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)家對(duì)藥品監(jiān)管力度的不斷加強(qiáng)，以及生物制藥領(lǐng)域市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈，如何更好更快的將目的蛋白提純就愈發(fā)顯得重要，不僅要求純化收率的提高，更要保證分離純化的純度和質(zhì)量?，F(xiàn)在針對(duì)不同產(chǎn)品、不同蛋白質(zhì)研發(fā)其專屬的、特異性的層析技術(shù)、層析介質(zhì)就成為蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域一個(gè)重要的發(fā)展方向。