劉海青　劉富平　胡文婷

摘要：為獲得低毒廉價新型魚藥，采用牛津杯法和試管二倍稀釋法分別測定壯實鹿角珊瑚生物堿對溶珊瑚弧菌、塔氏弧菌、鯊魚弧菌的敏感性、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并與對照環(huán)丙沙星進行比較。結(jié)果表明，壯實鹿角珊瑚生物堿對3種弧菌的體外抗菌活性與環(huán)丙沙星相近。

關(guān)鍵詞：壯實鹿角珊瑚；生物堿；病原性海洋弧菌；體外抗菌活性

中圖分類號： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0250-02

收稿日期：2013-05-30

基金項目：長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（編號：IRT1123）；海南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究資助（編號：Hjkj）；海南大學(xué)青年基金（編號：qnjj1151）。

作者簡介：劉海青（1971—），女，山西大同人，碩士研究生，副教授，從事天然產(chǎn)物活性研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。

通信作者：劉富平（1974—），男，山西榆次人，博士，副教授，從事微生物制藥研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。病原性海洋弧菌是一群在海洋環(huán)境中最常見的條件致病菌?；魜y弧菌和副溶血弧菌是引起人類細(xì)菌性食物中毒的首要食源性致病菌[1]，大部分魚類易患的弧菌病一般由溶藻弧菌所引起[2]，溶珊瑚弧菌則會導(dǎo)致雜色鮑幼苗急性死亡脫落癥大規(guī)模暴發(fā)，其毒性比溶藻弧菌更強[3]。為了預(yù)防水產(chǎn)動物疾病，大量抗生素類藥物被用作水產(chǎn)藥物，但長期過度使用又使得菌株的耐藥性和抗生素殘留問題日益突出。來源于自然界的生物堿類化合物資源豐富、抗菌譜廣，對包括耐藥菌在內(nèi)的菌株抗菌效果良好。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚所處環(huán)境雖艱難惡劣卻極少被魚類或其他生物捕食，而且能夠排斥海藻生長，防止其他生物棲息，具有自身產(chǎn)生的各種次生代謝產(chǎn)物構(gòu)建的防御體系[4]。所以，本研究以海南島蜈支洲海域壯實鹿角珊瑚為試驗材料，提取生物堿及其他含氮雜環(huán)，以對水產(chǎn)品危害較大的致病弧菌為受試菌種進行抗菌活性篩選，希望獲得低毒廉價的抗菌活性良好的化合物，應(yīng)用于弧菌病害的防治。

1材料與方法

1.1受試菌種

溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）、塔氏弧菌（Vibrio tubiashii）、鯊魚弧菌（Vibrio carchariae）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所提供。壯實鹿角珊瑚（Acropora robusta）采自海南島蜈支洲海域。

1.2培養(yǎng)基的制備

液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母浸出膏1 g、磷酸鐵0.01 g、過濾陳海水1 000 mL，pH值為7.6～7.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 備用。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母浸出膏1 g、磷酸鐵0.01 g、瓊脂粉18 g、過濾陳海水1 000 mL，pH 值為7.6～7.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3藥液的制備

1.3.1體外抑菌試驗藥液的配制準(zhǔn)確稱取適量的藥品，用無菌蒸餾水分別配制成濃度為500、1 000 μg/mL 的藥液各100 mL，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后分裝，使用前配制。

1.3.2抗生素后效應(yīng)（PAE）藥液的配制用上述方法配制100、200、400倍的MIC（最小抑菌濃度）的各種藥液，121 ℃高壓蒸汽滅菌20min，-20 ℃貯存?zhèn)溆?，臨用前稀釋到所需要的倍數(shù)。

1.4鹿角珊瑚生物堿的提取

稱取濕重壯實鹿角珊瑚4 kg的樣品，粉碎，分為4份，每份1 kg，分別加入珊瑚樣品10倍量的1%HCl、30%乙醇、70%乙醇、90%乙醇，回流提取1 h。記錄每份提取液的體積，采用HPLC法測定珊瑚生物堿含量，以珊瑚生物堿含量作為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，以70%乙醇提取的珊瑚生物堿含量較高。另以50%、60%、70%乙醇回流提取珊瑚樣品，結(jié)果表明，以60%乙醇提取的珊瑚生物堿含量最高，所以確定采用60%乙醇為后續(xù)試驗提取溶媒。

稱取10 kg濕重鹿角珊瑚，粉碎，加入珊瑚樣品8倍量的60%乙醇回流提取2 h，提取3次，過濾，合并3次濾液，減壓回收乙醇至干，得浸膏。浸膏經(jīng)硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜分離，分別用三氯甲烷-甲醇（100 ∶0→0 ∶100）、石油醚-丙酮（100 ∶0→0 ∶100）、水-甲醇（100 ∶100 →0 ∶100）梯度洗脫，洗脫物再經(jīng)反復(fù)分離純化，重結(jié)晶，得到生物堿10 mg，碘化鉍鉀試劑定性鑒定。

1.5體外抑菌試驗

1.5.1藥物敏感性測定將3株供試菌分別劃線接種于平皿培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h；挑選單個菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng) 24 h；用 2 mL 0.9% NaCl溶液進行洗脫即制得所需菌懸液。

采用牛津杯法對2種藥物進行敏感性測定試驗。吸取培養(yǎng) 8～10 h 的 3 種弧菌菌液 0.1 mL，分別均勻涂布在直徑為 9 cm 的平板培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中約放置20 min。待培養(yǎng)基表面稍干后，用無菌鑷子夾取牛津杯分別置于平板表面，使牛津杯與培養(yǎng)基緊密接觸，每個平板表面放4個牛津杯，每種藥液加 2 杯作為平行樣，每杯加 200 μL 500 μg/mL的各種藥液，置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測量牛津杯周圍各種藥物抑菌圈的直徑，每杯取不同方向測量 2 次，最后求平均值。每種藥物均試驗 2 次，按藥物敏感度標(biāo)準(zhǔn)判定敏感度。

1.5.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定試管2倍稀釋法略作改進，以環(huán)丙沙星為陽性對照。endprint

2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對2種抗菌藥物的敏感性定性試驗

試驗藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對試驗菌株的MIC、MBC的測定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長[12]。本研究通過對藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進行測定，結(jié)果表明，壯實鹿角珊瑚生物堿對3 種試驗菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說明可以進一步對該生物堿進行結(jié)構(gòu)測定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]夏凡，楊麗君，王靜，等. 病原性海洋弧菌致病機理及其快速檢測方法研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2011，32（1）：366-370，376.

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[5]王志強，陳杖榴. 獸用氟喹諾酮類的抗菌后效應(yīng)、抗菌后亞抑制濃度效應(yīng)，亞抑制濃度效應(yīng)[J]. 中國獸藥雜志，2001，35（5）：13-17.

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[8]劉滌潔，陳杖榴，馮淇輝. 恩諾沙星和環(huán)丙沙星對金葡菌的抗菌后效應(yīng)及抗菌后亞抑菌濃度效應(yīng)[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2002，22（3）：276-278.

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[12]胡大強，陳雅. 氟喹諾酮藥物的抗生素后效應(yīng)研究概況[J]. 中國藥業(yè)，2004，13（1）：76-77.石桃雄，顧亮亮，陳澤林，等. 金蕎收集系葉片黃酮、可溶性蛋白、可溶性糖含量分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：252-255.

2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對2種抗菌藥物的敏感性定性試驗

試驗藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對試驗菌株的MIC、MBC的測定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長[12]。本研究通過對藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進行測定，結(jié)果表明，壯實鹿角珊瑚生物堿對3 種試驗菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說明可以進一步對該生物堿進行結(jié)構(gòu)測定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

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2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對2種抗菌藥物的敏感性定性試驗

試驗藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對試驗菌株的MIC、MBC的測定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長[12]。本研究通過對藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進行測定，結(jié)果表明，壯實鹿角珊瑚生物堿對3 種試驗菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說明可以進一步對該生物堿進行結(jié)構(gòu)測定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

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