孫勇　蔣繼宏

摘要：為了解藥用真菌紅緣擬層孔菌的最佳培養(yǎng)條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以葡萄糖、蛋白胨、黃豆粉煮汁、pH值為因素，以菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液抗腫瘤活性為標(biāo)準(zhǔn)，采用正交試驗方法從中選出最優(yōu)培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：紅緣擬層孔菌生長的最適溫度為25 ℃，中性偏酸性環(huán)境，最適碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，以菌絲干質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：葡萄糖25 g/L，蛋白胨10 g/L，黃豆粉煮汁3 g/L，pH值為6；以發(fā)酵液抗腫瘤活性為標(biāo)準(zhǔn)，最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，黃豆粉煮汁4 g/L，pH值為6。

關(guān)鍵詞：紅緣擬層孔菌；菌絲干質(zhì)量；抗腫瘤活性

中圖分類號：Q93-335文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0208-03

收稿日期：2013-05-20

基金項目：江蘇省徐州師范大學(xué)基金項目（編號：10XLA20）。

作者簡介：孫勇（1977—），男，江西高安人，碩士，講師，從事微生物學(xué)研究。 E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蔣繼宏，博士，教授。Tel：（0516）83403515；E-mail：jhjiang@xznu.edu.cn。紅緣擬層孔菌[Fomitopsis pinicola （Swartz.：Fr.）Karst.]分類上屬于多孔菌目多孔菌科擬層孔菌屬，是一種對云杉等針葉樹危害較大的木腐菌，引起木材木質(zhì)部褐色塊狀腐朽，對小白鼠肉瘤180及艾氏肉瘤抑制率分別為70%和80%[1]。近來的研究結(jié)果表明，紅緣擬層孔菌水提取物能降低血糖濃度，升高血液中HDL濃度，降低LDL濃度[2]；紅緣擬層孔菌多糖能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成，乙醇提取物能夠抑制IFN-γ誘導(dǎo)的炎癥標(biāo)記物IP-10的生成，但對脈管內(nèi)皮細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用[3]；紅緣擬層孔菌提取物能夠清除DPPH自由基、超氧化物陰離子自由基；對SK-Hep3B、HeLa、HO-1、PLC/RF/5、Hep3B、SNU354、SNU185等腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞毒性作用（醇提物活性比水提物活性強(qiáng)）[4]；紅緣擬層孔菌的石油醚相、乙酸乙酯相和甲醇相提取物對HeLa細(xì)胞的IC50分別為71.04、36.43、198.04 μg/mL，對SMMC-7721的IC50分別為45.22、35.63、187.56 μg/mL[5]；Yoshikawa等發(fā)現(xiàn)紅緣擬層孔菌有3種三萜類化合物具有選擇性抑制COX-2的作用[6]；Isabelle 等研究了紅緣擬層孔菌的抗木霉菌活性[7]。綜上所述，紅緣擬層孔菌具有消炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，是一種具有開發(fā)前景的藥用真菌。我們從黑龍江省長白山上采集到野生子實體，對其進(jìn)行分離馴化研究，研究溫度、酸堿度和營養(yǎng)條件對該菌株生長的影響，為了解該菌的培養(yǎng)特性和進(jìn)一步研究開發(fā)做準(zhǔn)備。

1材料與方法

1.1供試菌種和腫瘤細(xì)胞

供試菌種：紅緣擬層孔菌菌種，由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室提供，分離自東北長白山紅緣擬層孔菌子實體。

胃腺癌腫瘤細(xì)胞：SGC-7901。

1.2溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

將分離得到的紅緣擬層孔菌菌種用PDA平板在26 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)6 d，使其形成可供試驗的菌落，用無菌的打孔器取直徑5 mm的菌落塊，置于PDA平板中，每皿放3塊，呈等邊三角形放置，分別置于10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)6 d，用“十”字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落形態(tài)、菌絲長勢。菌絲長勢濃密健壯用“+++”表示，生長較濃密用“++”表示，生長較稀疏用“+”表示，生長稀疏用空白表示，不生長用“-”表示。

1.3pH值對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L 鹽酸將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11共7個梯度。將不同pH值的培養(yǎng)基倒入直徑為 90 mm 的培養(yǎng)皿中，制成固體平板，置于26 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d。用“十”字交叉法測量菌落直徑，觀察記載菌絲生長勢。生長勢表示方法同上。

1.4紅緣擬層孔菌對碳源和氮源的利用

供試碳源：淀粉、糊精、羧甲基纖維素鈉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇。

供試氮源：氯化氨、硝酸鉀、黃豆粉、酵母粉、蛋白胨、尿素。

碳源利用試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：0.32 g硝酸銨，1 g 磷酸二氫鉀，0.5 g MgSO4·7H2O，0.005 g/L 維生素B1，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL。以2%的量加入不同的碳源，自然pH值，在每一平板中接入直徑5 mm的菌落3塊，呈等邊三角形排列，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)6 d，“十”字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落形態(tài)、菌絲長勢。

氮源利用試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：20 g葡萄糖，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.005 g 維生素B1，20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL，以10 g/L的量加入5種不同的氮源，自然pH值，其他方法同碳源試驗。以氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照。

1.5正交試驗設(shè)計

從碳氮源試驗結(jié)果中選出最好的碳源和氮源作為正交試驗因素，結(jié)合pH值因素，采用正交設(shè)計進(jìn)行最佳培養(yǎng)條件試驗。采用150 mL三角瓶培養(yǎng)（裝液量50 mL），每處理重復(fù)3次。

1.6MTT法測定紅緣擬層孔菌抗腫瘤活性

人胃腺癌腫瘤細(xì)胞SGC-7901以8×104個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，在5%CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入提取物濃度為100 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去溶液，用200 μL基本培養(yǎng)基洗1次，每孔加入50 μL 37 ℃預(yù)熱的MTT（2 mg/mL）4 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗一次，每孔加200 μL DMSO，在平板搖床上搖30 min，在酶標(biāo)儀570 nm下讀板，根據(jù)測得的吸光度計算抑制率。

抑制率=（1-試驗組吸光度/對照組吸光度）×100%

2結(jié)果與分析

2.1溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

由表1可知：紅緣擬層孔菌生長最快的溫度為30 ℃，培養(yǎng)6 d的菌落直徑達(dá)7.5 cm，紅緣擬層孔菌低于10 ℃和高于40 ℃時均不生長，25 ℃生長速度慢， 但菌絲的生長勢明顯高

表1不同溫度下紅緣擬層孔菌的菌落

溫度（℃）1菌落直徑（cm）1生長勢1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培養(yǎng)時間為6 d。同列數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示差異達(dá)0.01和0.05顯著水平。

于30 ℃時的生長勢，說明紅緣擬層孔菌為中溫型菌類。

2.2pH值對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

紅緣擬層孔菌在pH值7左右生長最好，培養(yǎng)基pH值 5～8 時菌絲生長無顯著差異，當(dāng)pH達(dá)到9以上時生長速度明顯變慢，生長勢變差（表2）。由此可見，紅緣擬層孔菌喜歡中性偏酸性環(huán)境。

3討論

本試驗結(jié)果表明，菌絲產(chǎn)量和發(fā)酵液抗腫瘤活性并不同步，產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液抗腫瘤活性不一定高，在供試水平內(nèi)，營養(yǎng)成分越高，產(chǎn)量越高，但抗腫瘤活性水平不高，可能是營養(yǎng)豐富的條件下，菌絲處于快速生長期，代謝產(chǎn)物還沒有積累，培養(yǎng)時間加長可能更有利于活性成分的積累。

MTT法測定抗腫瘤活性時，發(fā)酵液的酸堿度對腫瘤細(xì)胞的生長有一定的影響，試驗時發(fā)酵液pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至7左右才能排除發(fā)酵液偏酸的影響，另外，本試驗發(fā)酵液的測定是在稀釋10倍的條件下測定的，因而，基本可以排除pH值對腫瘤細(xì)胞的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]卯曉嵐. 中國大型真菌[M]. 鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000：465.

[2]Wol-Suk C，Ding J L，Hyun-Jae S，et al. Effect of fomitopsis pinicola extract on blood glucose and lipid metabolism in diabetic rats[J]. Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26（6）：1696-1699.

[3]Cheng J J，Lin C Y，Lur H S，et al. Properties and biological functions of polysaccharides and ethanolic extracts isolated from medicinal fungus，F(xiàn)omitopsis pinicola[J]. Process Biochemistry，2008，43：829-834.

[4]Choi D，Sang-Shin P，Ding J L，et al. Effects of fomitopsis pinicola extract on antioxydant and antitumor activities[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12：516-524.

[5]Ren G，Liu X Y，Zhu H K，et al. Evaluation of cytotoxic activities of some medicinal polypore fungi from China[J]. Fitoterapia，2006，77（5）：408-410.

[6]Yoshikawa K，Inoue M，Matsumoto Y，et al. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2[J]. Journal of Natural Products，2005，68（1）：69-73.

[7]Isabelle S G，Daniel J，Hmamda A. Selection of grifola frondosa and fomitopsis pinicola strains resistant to trichoderma viride in Teflon tubes confrontation method[J]. Mycological Progress，2004，3（4）：329-336.張金霞，王華磊，郭玉海，等. 一種簡易觀察管花肉蓯蓉寄生過程的方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：211-212.

抑制率=（1-試驗組吸光度/對照組吸光度）×100%

2結(jié)果與分析

2.1溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

由表1可知：紅緣擬層孔菌生長最快的溫度為30 ℃，培養(yǎng)6 d的菌落直徑達(dá)7.5 cm，紅緣擬層孔菌低于10 ℃和高于40 ℃時均不生長，25 ℃生長速度慢， 但菌絲的生長勢明顯高

表1不同溫度下紅緣擬層孔菌的菌落

溫度（℃）1菌落直徑（cm）1生長勢1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培養(yǎng)時間為6 d。同列數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示差異達(dá)0.01和0.05顯著水平。

于30 ℃時的生長勢，說明紅緣擬層孔菌為中溫型菌類。

2.2pH值對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

紅緣擬層孔菌在pH值7左右生長最好，培養(yǎng)基pH值 5～8 時菌絲生長無顯著差異，當(dāng)pH達(dá)到9以上時生長速度明顯變慢，生長勢變差（表2）。由此可見，紅緣擬層孔菌喜歡中性偏酸性環(huán)境。

3討論

本試驗結(jié)果表明，菌絲產(chǎn)量和發(fā)酵液抗腫瘤活性并不同步，產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液抗腫瘤活性不一定高，在供試水平內(nèi)，營養(yǎng)成分越高，產(chǎn)量越高，但抗腫瘤活性水平不高，可能是營養(yǎng)豐富的條件下，菌絲處于快速生長期，代謝產(chǎn)物還沒有積累，培養(yǎng)時間加長可能更有利于活性成分的積累。

MTT法測定抗腫瘤活性時，發(fā)酵液的酸堿度對腫瘤細(xì)胞的生長有一定的影響，試驗時發(fā)酵液pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至7左右才能排除發(fā)酵液偏酸的影響，另外，本試驗發(fā)酵液的測定是在稀釋10倍的條件下測定的，因而，基本可以排除pH值對腫瘤細(xì)胞的影響。

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抑制率=（1-試驗組吸光度/對照組吸光度）×100%

2結(jié)果與分析

2.1溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

由表1可知：紅緣擬層孔菌生長最快的溫度為30 ℃，培養(yǎng)6 d的菌落直徑達(dá)7.5 cm，紅緣擬層孔菌低于10 ℃和高于40 ℃時均不生長，25 ℃生長速度慢， 但菌絲的生長勢明顯高

表1不同溫度下紅緣擬層孔菌的菌落

溫度（℃）1菌落直徑（cm）1生長勢1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培養(yǎng)時間為6 d。同列數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示差異達(dá)0.01和0.05顯著水平。

于30 ℃時的生長勢，說明紅緣擬層孔菌為中溫型菌類。

2.2pH值對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響

紅緣擬層孔菌在pH值7左右生長最好，培養(yǎng)基pH值 5～8 時菌絲生長無顯著差異，當(dāng)pH達(dá)到9以上時生長速度明顯變慢，生長勢變差（表2）。由此可見，紅緣擬層孔菌喜歡中性偏酸性環(huán)境。

3討論

本試驗結(jié)果表明，菌絲產(chǎn)量和發(fā)酵液抗腫瘤活性并不同步，產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液抗腫瘤活性不一定高，在供試水平內(nèi)，營養(yǎng)成分越高，產(chǎn)量越高，但抗腫瘤活性水平不高，可能是營養(yǎng)豐富的條件下，菌絲處于快速生長期，代謝產(chǎn)物還沒有積累，培養(yǎng)時間加長可能更有利于活性成分的積累。

MTT法測定抗腫瘤活性時，發(fā)酵液的酸堿度對腫瘤細(xì)胞的生長有一定的影響，試驗時發(fā)酵液pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至7左右才能排除發(fā)酵液偏酸的影響，另外，本試驗發(fā)酵液的測定是在稀釋10倍的條件下測定的，因而，基本可以排除pH值對腫瘤細(xì)胞的影響。

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[5]Ren G，Liu X Y，Zhu H K，et al. Evaluation of cytotoxic activities of some medicinal polypore fungi from China[J]. Fitoterapia，2006，77（5）：408-410.

[6]Yoshikawa K，Inoue M，Matsumoto Y，et al. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2[J]. Journal of Natural Products，2005，68（1）：69-73.

[7]Isabelle S G，Daniel J，Hmamda A. Selection of grifola frondosa and fomitopsis pinicola strains resistant to trichoderma viride in Teflon tubes confrontation method[J]. Mycological Progress，2004，3（4）：329-336.張金霞，王華磊，郭玉海，等. 一種簡易觀察管花肉蓯蓉寄生過程的方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：211-212.