林小園　劉紅全　袁衛(wèi)生

摘要：微藻的營養(yǎng)豐富，在生活和生產(chǎn)實(shí)踐中備受研究者的親睞，但由于海洋微藻的長時(shí)間培養(yǎng)和多次接種易導(dǎo)致藻種污染或遺傳漂變，使微藻的科研工作和商業(yè)化開發(fā)受到極大的限制。因此有效的藻種保存方法是進(jìn)一步研究和開發(fā)利用海洋微藻的關(guān)鍵。玻璃化保存技術(shù)是一門新興的生物技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效等特點(diǎn)，是目前海洋微藻種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存的理想方法?，F(xiàn)對玻璃化法超低溫保存的原理、優(yōu)點(diǎn)，玻璃化凍存法的操作程序、影響因素、關(guān)鍵技術(shù)和海洋微藻凍存苗的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，并對其今后的發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：海洋微藻；玻璃化凍存；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S917.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0190-05

收稿日期：2013-05-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30960215）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：桂科青0728019）。

作者簡介：林小園（1989—），女，碩士研究生，主要從事海洋微藻的種質(zhì)保存及多不飽和脂肪酸研究。E-mail：lxyqzw@126.com。

通信作者：劉紅全，副教授。E-mail：lhongquan@163.com。近年來，隨著陸地資源的衰竭，豐富的海洋微藻資源成了人們研究的熱點(diǎn)。海洋微藻含有高價(jià)值的營養(yǎng)成分及藥物活性成分，如蛋白質(zhì)、色素、脂肪類、維生素等生物活性物質(zhì)[1-3]，是具有巨大應(yīng)用價(jià)值的潛在資源；但由于藻種保存技術(shù)的限制，已成為海洋微藻資源商業(yè)化培養(yǎng)開發(fā)的瓶頸。分離純化得到1個(gè)單藻種，往往需花費(fèi)數(shù)月時(shí)間甚至更長，尤其篩選出1個(gè)優(yōu)良的、有應(yīng)用價(jià)值的微藻藻種就更加困難，因此成功的保種方法是微藻培養(yǎng)和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前海洋微藻在科研和實(shí)踐生產(chǎn)中常采用的保種方法有繼代培養(yǎng)法、固定化保存、超低溫保存法。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多弊端，如繼代培養(yǎng)在長時(shí)間培養(yǎng)、多次接種下，易導(dǎo)致藻種污染或者遺傳漂變，生命力減退等失去良種的價(jià)值。固定化培養(yǎng)程序較復(fù)雜，需要細(xì)心操作，而且大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會(huì)從膠珠中溢出，有的膠珠還會(huì)融解，導(dǎo)致保種失敗。雖然大量試驗(yàn)結(jié)果表明，超低溫凍存法將存活率提高到30%以上，但同樣存在一些缺陷，需要復(fù)雜的預(yù)冷凍程序，費(fèi)用較高，耗時(shí)長且不可避免凍融過程中晶體的形成，對保存材料造成損傷。因此研究者在超低溫貯存技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了新的探索，發(fā)展起來包埋-脫水法和玻璃化法2種新的冷凍保存技術(shù)。包埋-脫水法操作簡單，但存活率較低，僅為15%[4]，而玻璃化凍存法不僅可以克服前幾種保存技術(shù)中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、易污染等弊病，而且超低溫還可能殺滅有害致病菌，達(dá)到實(shí)現(xiàn)種質(zhì)長期保存的目的[5]。經(jīng)過玻璃化凍存的藻種相當(dāng)于進(jìn)行了一次優(yōu)勝劣汰的復(fù)壯作用，復(fù)蘇后存活下來的藻細(xì)胞一般會(huì)比未凍存的長得更好、更高產(chǎn)和抗凍性更強(qiáng)[6]。因此將玻璃化法用于海洋微藻種質(zhì)的凍存將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

1海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

自1985年Rall等[7]首次應(yīng)用玻璃化冷凍技術(shù)成功保存小鼠胚胎至今，已成功凍存了小鼠、兔、牛、豬、山羊等多種哺乳動(dòng)物胚胎。目前玻璃化凍存技術(shù)的研究和應(yīng)用多見于動(dòng)物胚胎和高等植物種質(zhì)的保存[8-10]，對于藻類的研究較少，但已有成功報(bào)道。如項(xiàng)黎新等[11]對衣藻細(xì)胞玻璃化凍存，獲得31.45%的存活率，恢復(fù)培養(yǎng)后其生長規(guī)律和未凍存的衣藻一致；Day采用該法保存小球藻配子體時(shí)，存活率高達(dá)100%[12]。劉麗娜等[13]也采用了此方法對湛江等地鞭金藻進(jìn)行保存，存活率高達(dá)54%。這表明玻璃化法在藻類種質(zhì)的超低溫保存中具有較大的應(yīng)用潛力。

“玻璃化”是一個(gè)物理學(xué)上的概念，指當(dāng)水或溶液快速降溫達(dá)到或低于-100～-110 ℃的溫度范圍時(shí)，形成一種具有高粘度的介于液態(tài)和固態(tài)之間非晶體態(tài)、雜亂無章、透明的玻璃狀態(tài)[14]。其物理性能與晶體態(tài)不同，是一種可以減輕或避免冷凍細(xì)胞及組織的損傷，達(dá)到長期保存的良好方法。玻璃化冷凍技術(shù)與常規(guī)的保存方法（如繼代培養(yǎng)，低溫凍存）相比，具有以下優(yōu)勢[15]：（1）簡化了冷凍操作步驟，無需貴重的程序降溫儀，整個(gè)操作就短短幾分鐘。（2）能夠有效避免胞內(nèi)冰晶的形成，從而降低細(xì)胞因形成冰晶而導(dǎo)致各種物理及化學(xué)的損傷。（3）玻璃化凍存有效抑制細(xì)胞的代謝活動(dòng)，長期保持生物遺傳穩(wěn)定性。玻璃化凍存簡單、高效的特點(diǎn)，近年來備受關(guān)注，是今后微藻冷凍保存技術(shù)的發(fā)展方向。不過玻璃化冷凍保存對保護(hù)劑組合、濃度及降溫升溫速率有特殊的要求。保護(hù)劑組合的總濃度一般要高達(dá)5.0～7.0 mol/L 才能實(shí)現(xiàn)玻璃化凍存，而高濃度的保護(hù)劑對保存材料產(chǎn)生嚴(yán)重毒性，因此在保存細(xì)胞或組織時(shí)，減少保護(hù)劑的毒性至關(guān)重要。

2海洋微藻玻璃化凍存的程序及研究進(jìn)展

海洋微藻自身是否有抗凍性對存活率產(chǎn)生重大的影響，對于冷敏感的微藻應(yīng)選用繼代培養(yǎng)保存法。因?yàn)樵孱惣?xì)胞含水量及液泡化程度高，在液氮保存中，0 ℃以下至低共熔點(diǎn)的溫度范圍內(nèi)，都處于危險(xiǎn)狀態(tài)，因此冷敏感的藻種不利于低溫貯存。同時(shí)對于具有抗凍性的藻種在低溫貯存中，從冷凍保護(hù)劑預(yù)處理、常溫到低溫、低溫儲(chǔ)存以及從低溫恢復(fù)到常溫和保護(hù)劑的去除等都至關(guān)重要，稍有操作失誤都會(huì)使細(xì)胞致死。因此根據(jù)藻種的差異性選擇合適的保存方法，對于超低溫凍存的藻種，應(yīng)盡可能選擇毒性小，抗凍效果好的保護(hù)劑及優(yōu)化凍存程序。液氮貯存相對其他貯存方法，是長久保持種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性較有效的方法，且凍存技術(shù)相對成熟。

2.1海洋微藻材料的選擇

1976年，Morris就對多種不同的種、株小球藻進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，結(jié)果表明抗凍性存在極大差異。低溫凍存的存活率跟藻種細(xì)胞的生長時(shí)期有關(guān)，有研究報(bào)道有些藻種處于靜止期時(shí)細(xì)胞抗凍性較好，存活率高于指數(shù)期細(xì)胞。如王起華等[16]對牟氏角刺藻和新月菱形藻進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明靜止期細(xì)胞的存活率顯著高于指數(shù)期。但也有研究報(bào)道某些藻種的指數(shù)生長期的抗凍性高于靜止期[17]。然而Ben-Amotz等[18]對12種海藻的冷凍保存研究發(fā)現(xiàn)抗凍性與藻細(xì)胞的生長時(shí)期無關(guān)。對此尚未見到有關(guān)細(xì)胞生長時(shí)期對凍存存活率影響的深入研究，因此不同生長時(shí)期細(xì)胞的抗凍性可能與藻種有關(guān)，對于不同的藻種應(yīng)選用抗凍性較好的那個(gè)生長階段的細(xì)胞進(jìn)行凍存。

2.2冷凍保存前的預(yù)培養(yǎng)及低溫馴化

2.2.1預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)是對培養(yǎng)條件做適宜的改變，以提高藻類的抗凍性。如對某些營養(yǎng)鹽進(jìn)行限制，營養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件（光照，溫度）的改變誘導(dǎo)出較大的抗凍性。Mortaint-Bertrand[19]等通過限制培養(yǎng)基中碳酸氫鈉和磷酸鹽的含量，明顯提高了杜氏鹽藻冰凍保存的存活率。項(xiàng)黎新等[11]取對數(shù)生長期的衣藻細(xì)胞離心濃縮，于不同的蔗糖濃度中光照預(yù)培養(yǎng)2 d再進(jìn)行玻璃化凍存，存活率達(dá)31.45%，且恢復(fù)培養(yǎng)后生長規(guī)律與未凍存的一致。

2.2.2低溫馴化 低溫馴化是一種常用的預(yù)處理方式，通過低溫馴化，細(xì)胞會(huì)發(fā)生保護(hù)性脫水，避免引起細(xì)胞內(nèi)大量結(jié)冰從而引起細(xì)胞死亡，這對低溫敏感藻種的玻璃化凍存極其重要[20]。Halmaggi等[21]在待凍存的藻液中加入一定濃度的葡萄糖或蔗糖，于4～15 ℃黑暗下馴化16～72 h，研究發(fā)現(xiàn)抗凍性明顯提高。王起華等將牟氏角剌藻和新月菱形藻進(jìn)行低溫黑暗馴化再凍存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藻種的抗寒性明顯提高，存活率提高10%左右[16]。

2.3玻璃化抗凍劑組合的篩選

抗凍保護(hù)劑具有較強(qiáng)的親水性，在水結(jié)冰過程中干擾水分子的晶格排列，抑制冰晶的形成，在一定程度上對凍存材料起保護(hù)作用。保護(hù)劑有滲透性和非滲透性兩大類，滲透性保護(hù)劑主要有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇等，可迅速滲入細(xì)胞內(nèi)，使胞內(nèi)溶質(zhì)增加，降低細(xì)胞膜對水的通透性，同時(shí)充分脫水，避免凍存時(shí)冰晶形成造成傷害。但是滲透性保護(hù)劑具有一定毒性，因此保存材料在玻璃化液中暴露的時(shí)間盡可能短，溫度盡量低。非滲透性保護(hù)劑一般情況下不能自由擴(kuò)散透過細(xì)胞膜，主要有葡萄糖、蔗糖和海藻糖等低分子糖類。非滲透性保護(hù)劑可為細(xì)胞提供一個(gè)高滲環(huán)境限制水分過快進(jìn)入細(xì)胞，避免解凍時(shí)發(fā)生滲透性休克，起特異性保護(hù)作用。

在冷凍過程中，常將這兩類保護(hù)劑聯(lián)合使用，因?yàn)橛行┍Ｗo(hù)劑如甘油，乙二醇等，滲透作用強(qiáng)、化學(xué)毒性小，但玻璃化能力稍差，而有些保護(hù)劑如二甲基亞砜，玻璃化狀態(tài)效果好，但滲透性較差，毒性大。并且要形成較好的玻璃化狀態(tài)，保護(hù)劑組合的濃度需高達(dá)5～7 mol/L，因此將這些保護(hù)劑配合使用后能功能互補(bǔ)，既保證了抗凍劑的滲透性，較好的玻璃化能力又降低了使用單一保護(hù)劑高濃度的毒性。

2.4冰凍保存的操作程序

2.4.1凍存時(shí)藻細(xì)胞的預(yù)處理在藻細(xì)胞凍存前，需先對保護(hù)劑的濃度及預(yù)平衡時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，確定較適合的保護(hù)劑濃度及預(yù)處理時(shí)間，因?yàn)楦邼舛鹊谋Ｗo(hù)劑對細(xì)胞有毒害性，毒性大小與使用濃度及處理時(shí)間相關(guān)[22]。確定保護(hù)劑濃度后，將保護(hù)劑組合配制成使用體積分?jǐn)?shù)的2倍，先用稀釋到使用時(shí)一半濃度的玻璃化溶液對藻細(xì)胞預(yù)平衡。預(yù)平衡時(shí)間的長短因藻種而異，處理時(shí)間過短或過長都會(huì)降低存活率，一般在 0 ℃ 或25 ℃下處理5～60 min[23]，如湛江等鞭金藻預(yù)處理 50 min[24]，小新月菱形藻預(yù)處理60 min[25]。采用逐步加入法，使細(xì)胞適度脫水，然后去除預(yù)平衡溶液，加入玻璃化溶液，迅速投入液氮中進(jìn)行保存，整個(gè)操作盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成，避免細(xì)胞在保護(hù)劑中暴露時(shí)間過長受到毒副作用。

2.4.2藻細(xì)胞的解凍操作凍存材料的復(fù)蘇一般采用快速解凍法，將凍存材料迅速轉(zhuǎn)移到40 ℃水浴中，快速振蕩直至最后1粒冰晶消失。然后在冰浴中或室溫下加入培養(yǎng)液稀釋，離心去除保護(hù)劑，再用培養(yǎng)基漂洗解凍材料2～3遍，洗滌時(shí)間根據(jù)藻細(xì)胞的耐滲透壓選擇[26]。解凍洗滌以快速除去高濃度的玻璃化保護(hù)劑，避免保護(hù)劑對細(xì)胞造成傷害。值得注意的是對于細(xì)胞表面有角毛或鞭毛的藻種，不適合采用離心法去除保護(hù)劑，直接用稀釋法，因?yàn)樵陔x心過程中易造成機(jī)械傷害而影響存活率[16]。

2.4.3解凍后的恢復(fù)培養(yǎng)化凍后的材料需在特定培養(yǎng)條件下才能更好地快速恢復(fù)生長，再培養(yǎng)條件如光照、溫度、營養(yǎng)液溶度等對存活率均有較大影響[27]。有結(jié)果表明經(jīng)玻璃化凍存后的材料先暗培養(yǎng)1 d再過渡到光照中培養(yǎng)，存活率均高于直接光照培養(yǎng)，且能較快恢復(fù)正常生長。至于化凍后先經(jīng)暗培養(yǎng)再光照培養(yǎng)可提高存活率的機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究。

2.5存活率的測定

目前不同測定方法的可靠性差異很大，因此對細(xì)胞存活率的準(zhǔn)確估計(jì)存在較大誤差，也是影響存活率的一個(gè)因素。近幾年應(yīng)用較多的存活率測定法是分光光度法及溶液培養(yǎng)-細(xì)胞計(jì)數(shù)法。其中分光光度法是將恢復(fù)生長后的藻液，于分光光度計(jì)一定波長下測得吸光度，根據(jù)預(yù)先確定好的藻細(xì)胞密度（y）與吸光度（x）的直線回歸方程推算出冷凍后的細(xì)胞密度，然后與對照組進(jìn)行比較，得出比值即為存活率[28-29]。溶液培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法，是將復(fù)蘇后恢復(fù)生長到一定天數(shù)（n）的藻液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞密度，根據(jù)回歸方程Y=aXb（Y為培養(yǎng)n d后的藻細(xì)胞密度，X為藻細(xì)胞的初始密度，此方程由不同初始密度的藻液與培養(yǎng)n d后測得的藻細(xì)胞密度擬合所得）計(jì)算出活細(xì)胞密度，與對照組對比獲得存活率[30-31]。

除此之外，細(xì)胞存活率的測定法還有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力測定法、光合放氧活性測定法及葉綠素含量測定法等。不同測定方法的可靠性差異極大，因此對于保存方法優(yōu)劣的評估較為困難。

3海洋微藻玻璃化凍存苗的應(yīng)用前景

隨著微藻種質(zhì)玻璃化保存技術(shù)不斷深入研究和完善，使得海洋微藻在開發(fā)和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮越來越大的作用。如建立微藻玻璃化保存種質(zhì)庫，保持一些稀有的及瀕危微藻的種質(zhì)資源，便于國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流中微藻種質(zhì)的交換。同時(shí)通過玻璃化凍存有可能培養(yǎng)出抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良微藻新品系，為低溫生物學(xué)領(lǐng)域提供新的資料。過去海洋微藻的商業(yè)化開發(fā)主要用作海產(chǎn)養(yǎng)殖的食物餌料，而隨著研究工作的深入，通過微藻種質(zhì)的保存、選育，養(yǎng)殖方式的選擇及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可獲得人們期望的大量代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)在海洋微藻的養(yǎng)殖及產(chǎn)品開發(fā)已經(jīng)成為新興生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)[32-33]，在食品、醫(yī)藥、化妝品、生物新能源、環(huán)境污水及廢氣的處理中顯現(xiàn)出廣闊的前景。

3.1作為營養(yǎng)保健品廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域

海洋微藻富含蛋白質(zhì)、色素、多糖及PUFAs，在醫(yī)藥和保健品的開發(fā)應(yīng)用方面具有巨大的潛力[34]。據(jù)報(bào)道小球藻的蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，是大豆的2倍、雞蛋的6倍、大米的10倍，而且微藻中還含有高含量的礦物質(zhì)元素、人體必需氨基酸及維生素等，其中鐵質(zhì)含量和維生素A分別是葡萄干的50倍、4倍，豬肝的16倍；鈣含量是牛奶的2倍；同時(shí)還含有比鵝肝更高的維生素B12[35]。目前許多國家把可食用微藻與其他保健品原料混合加工成保健食品（粉劑、片劑、膠囊劑），如餅干、營養(yǎng)塊和飲料等，已上市的保健食品有賜拜年小球藻粉、施普瑞螺旋藻膠囊、新大澤螺旋藻營養(yǎng)早餐、綠A天元甘露等產(chǎn)品（中國植物微藻DHA行業(yè)市場調(diào)查報(bào)告2013版）。美國夏威夷納斯達(dá)克上市公司從雨生紅球藻中提取蝦青素，生產(chǎn)出了BioA-stin天然蝦青素膠囊，并通過美國FDA認(rèn)證，達(dá)到GMP標(biāo)準(zhǔn)，其抗氧化能力是維生素E的550倍，是β-胡蘿卜素的10倍[36]。此活性物質(zhì)加入化妝品具有增加皮膚彈性，潤膚保濕，祛斑除皺紋的功效，法國最早將螺旋藻加入化妝品（如面膜、護(hù)發(fā)品、護(hù)膚霜等），備受消費(fèi)者的青睞。

同時(shí)PUFAs在營養(yǎng)學(xué)與醫(yī)學(xué)上具有不可比擬的作用，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。尤其是EPA和DHA，具有維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，防治心血管疾病、動(dòng)脈硬化、糖尿病、肥胖等人類疾病，提高人類記憶力。Angerer等[37]研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈病變的程度和脂肪組織中DHA濃度呈負(fù)相關(guān)，每天讓冠心病患者攝入一定量的w-3型多不飽和脂肪酸，可減緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病變速度。Robert等研究結(jié)果表明DHA對嬰兒大腦、眼的機(jī)能發(fā)育及視網(wǎng)膜組成，視力保護(hù)，提高記憶力和促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要的作用[38-39]。藻類培養(yǎng)不受季節(jié)和氣候限制，可全年進(jìn)行生產(chǎn)，且從海洋微藻中提取的脂肪酸組成簡單無魚腥味，提取工藝較為簡單。美國Martek公司已篩選得到高產(chǎn)EPA和DHA的藻種，其EPA和DHA的最終產(chǎn)量分別為 0.25、1.2 g/（L·d）。2013年5月15日，我國召開的第十一次全國營養(yǎng)科學(xué)大會(huì)，將DHA+EPA的推薦攝入量明確寫入DRIs（中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量）。目前，我國有不少生產(chǎn)嬰幼兒食品的廠家通過添加微藻油來提高產(chǎn)品中DHA的含量，如亨氏、貝因美、伊利、光明乳業(yè)、圣元等[40]。因此，海洋微藻油脂作為營養(yǎng)保健品的理想原料，目前在國內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)入應(yīng)用階段。

3.2用于水環(huán)境污染修復(fù)

近年來隨著工業(yè)的進(jìn)步和人們生活水平的提高，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，如廢氣過量排放，水資源的富營養(yǎng)化及重金屬污染等?，F(xiàn)階段污水處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。與傳統(tǒng)方法相比，利用生物法處理適用范圍廣、成本低、而且可以避免二次污染。尤其近幾年發(fā)展起來的藻類修復(fù)水環(huán)境污染的能力具有不可比擬的優(yōu)勢，海洋微藻資源豐富、廉價(jià)易得、生長速度快 適應(yīng)性強(qiáng)、吸附量大，不僅可以高效去除污水中的有機(jī)、無機(jī)以及重金屬等污染物，還可將培養(yǎng)微藻的污水處理同微藻餌料、生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)耦合，產(chǎn)生一定的附加值[41]。因此利用藻類進(jìn)行污水處理和水環(huán)境修復(fù)具有可行性。

許丹妮[42]初步研究了固定化小球藻對市政污水的凈化，結(jié)果表明，在人工污水pH值為7.2，水溫20 ℃的條件下對污水中的氨態(tài)氮凈化效率為65.05%；對PO43-的凈化效率達(dá)7817%。張靜霞[43]將小球藻于無氮磷的培養(yǎng)基中饑餓處理 24 h，后置于人工污水中培養(yǎng)72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對氮磷的去除率分別高達(dá)97%、99%。有研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻和小球藻在凈化重金屬污水中具有明顯的優(yōu)勢[44-45]，對Hg2+的吸附率可達(dá)到53. 8%。Chung 等用螺旋藻對沼氣發(fā)酵的豬糞廢水進(jìn)行二次處理，結(jié)果表明，氮的同化效率高達(dá)76%，且通過小鼠試驗(yàn)無毒性反應(yīng)[46]。張聰利用城市污水剩余污泥的抽提液培養(yǎng)小球藻和螺旋藻，發(fā)現(xiàn)污泥抽提液可部分取代傳統(tǒng)微藻培養(yǎng)的營養(yǎng)液，為藻蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供廉價(jià)的原料[47]。

Liu等認(rèn)為大部分廢水特別是食品工業(yè)的廢水（如糖蜜、乳制品的廢水）都可用來培養(yǎng)某些藻種，將獲得的微藻用作飼料或肥料，達(dá)到消除污染和再生能源雙贏的效果[48]。這種低成本、低耗能、效益明顯的廢水凈化方式，有著巨大的開發(fā)潛力。

3.3作為可再生能源

石油和煤炭等能源儲(chǔ)量的日益減少，且該能源在燃燒過程中會(huì)對空氣造成污染，使得不斷增長的需求與日益嚴(yán)重的環(huán)境污染之間形成尖銳的矛盾，因此尋找新的清潔的替代能源，已成為倍受人們關(guān)注的課題。微藻油脂含量高，利用光照產(chǎn)油的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了最好的油料作物，產(chǎn)生物柴油的量是最好油料作物的8～24倍[49-50]。并且海洋微藻的養(yǎng)殖在天然的海域即可，不與農(nóng)業(yè)爭地。因此海洋微藻作為一種重要的可再生能源物質(zhì)，無論從能源供給的角度還是從環(huán)境保護(hù)的角度來講，都具有科學(xué)意義。

研究發(fā)現(xiàn)海洋微藻的生長速度非?？欤谥笖?shù)生長期，生物量倍增時(shí)間可短至3.5 h，油脂含量占細(xì)胞干質(zhì)量的80%[51]。何峰等研究了不同碳源及生長條件對三角褐指藻總脂含量積累的影響，結(jié)果表明在葡萄糖濃度為20 mmol/L、溫度（25±1） ℃、光強(qiáng)25 μmol/（m2·s）、pH值7.5的條件下，總脂含量達(dá)到 20%（細(xì)胞干質(zhì)量），證實(shí)了該藻種可用于提取生物柴油[52]。賀立靜對微藻產(chǎn)氫進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明緣微囊藻、假魚腥藻、束絲藻、絲藻、萊茵衣菜、顫藻和銅綠微囊藻在TAP和TAP-S培養(yǎng)液中均能產(chǎn)氫，其中萊茵衣藻在TAP-S培養(yǎng)液中產(chǎn)氫最多，培養(yǎng)120 h總產(chǎn)氫量達(dá)到 4.77 mL，產(chǎn)氫速率0.63 mL/（h·L）[53]。1998年美國再生能源國家實(shí)驗(yàn)室通過現(xiàn)代生物技術(shù)，將來自小環(huán)藻的乙酞輔酶A梭化酶基因?qū)胄…h(huán)藻得到1株工程小環(huán)藻，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下該藻的總脂肪酸含量高達(dá)60%以上，戶外生產(chǎn)也可達(dá)到40%以上[54]。近年來采用基因工程技術(shù)構(gòu)造“工程微藻”的報(bào)道層出不窮[55-57]。2010年，中國科學(xué)院青島生物能源研究所與美國波音公司共同簽署了推進(jìn)藻類航空可持續(xù)生物燃料合作備忘錄，啟動(dòng)微藻航空生物柴油能源技術(shù)的大規(guī)模開發(fā)。微藻與陸生作物相比，具有生物量大、生長周期短、脂質(zhì)含量高等特點(diǎn)，已成為生物燃油原料的首選。因此大力發(fā)展微藻類生物柴油，對經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，推進(jìn)能源替代，舒緩環(huán)境壓力，控制大氣污染具有重要的戰(zhàn)略意義。

4展望

玻璃化凍存法綜合了傳統(tǒng)方法與超低溫保存技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，克服不足，使之在海洋微藻種質(zhì)資源保存中獨(dú)具潛力與優(yōu)勢。因此，采用玻璃化法建立海洋微藻的超低溫種質(zhì)資源庫已成為該領(lǐng)域今后發(fā)展的一個(gè)趨勢。玻璃化法超低溫保存研究雖然取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展，但是針對這一新興領(lǐng)域，還有許多問題需要做進(jìn)一步的探討與研究。如對于不同的藻種，未建立起與之相適應(yīng)的完善的保存體系。在整個(gè)方法體系中，針對不同材料的特性，選擇與之相適應(yīng)的冷凍保護(hù)劑組合及其濃度成為該技術(shù)的難點(diǎn)和重點(diǎn)；對于已保存的材料，在整個(gè)超低溫保存過程中所發(fā)生的生理生化反應(yīng)并不能完全描述清楚，如細(xì)胞的抗凍機(jī)理仍不明確，所以需對玻璃化法保存微藻的生化機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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