李肖爽，盧金清，戴藝，梁歡，李雨玲，黎強(qiáng)

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北武漢430065）

香莢蘭豆的TLC鑒別及香蘭素、對(duì)羥基苯甲醛的含量測定

李肖爽，盧金清*，戴藝，梁歡，李雨玲，黎強(qiáng)

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北武漢430065）

采用薄層色譜法（TLC）對(duì)香莢蘭豆原料進(jìn)行了定性鑒別，并用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定香莢蘭豆藥材中香蘭素和對(duì)羥基苯甲醛的含量。TLC法：采用正丁醇-無水乙醇-濃氨水（7∶2∶1）為展開劑，置紫外燈（254 nm）下檢視。HPLC法：采用Agilent ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫；體積流量1.0mg/mL；檢測波長分別為275 nm；柱溫25℃。TLC中斑點(diǎn)清晰可見。香蘭素線性范圍為0.408μg~0.816μg（r=0.999 8），平均回收率為100.13%，RSD為1.75%；對(duì)羥基苯甲醛線性范圍為0.004μg~0.020μg（r=0.9999），平均回收率為99.56%，RSD為1.20%。所測香莢蘭豆中，香蘭素和對(duì)羥基苯甲醛的平均含量分別為7.26%、0.37%。以上方法可靠、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于馬達(dá)加斯加香莢蘭豆的鑒別及其香蘭素及對(duì)羥基苯甲酸及含量測定。

香莢蘭豆；薄層色譜法；高效液相色譜法；香蘭素；對(duì)羥基苯甲醛

香莢蘭豆為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭Vanilla planifoli Andrews的成熟果實(shí)，具有息風(fēng)止痙、鎮(zhèn)靜抗驚等功效。綠色的香莢蘭鮮豆莢經(jīng)發(fā)酵生香等工藝后，形成和諧、優(yōu)雅的特有芳香氣味[1]。香莢蘭豆主要有效成分為醛類，其中香蘭素及對(duì)羥基苯甲醛作為其活性成分，是醫(yī)藥、香料工業(yè)等眾多領(lǐng)域的重要中間體，香莢蘭豆及制成品正適應(yīng)了人們的需求，因?yàn)樗粌H含有多種香氣成分，而且它還富含人體所需的氨基酸[2]。楊鹿佳[3]等將一定濃度的香莢蘭豆酊劑添加到各種卷煙中，并進(jìn)行了加香評(píng)吸驗(yàn)證。目前香蘭素在國內(nèi)食品工業(yè)中的消費(fèi)占香蘭素總消費(fèi)的55%，是食品添加劑行業(yè)中不可缺少的重要原料。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用同時(shí)蒸餾法對(duì)云南香莢蘭揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，在鑒定出的化合物中含有醛類，酯類，酚類，醇類等[4]；采用反相高效液相色譜法測定云南西雙版納香莢蘭商品中香莢蘭醛等化合物的含量[5]，但國內(nèi)外均無有關(guān)馬達(dá)加斯加原產(chǎn)地香莢蘭豆化學(xué)成分的研究報(bào)道。故本文采用TLC法對(duì)香莢蘭豆原料進(jìn)行了定性鑒別，并用HPLC法選擇合適的色譜條件對(duì)馬達(dá)加斯加原產(chǎn)地香莢蘭豆的特征性成分香蘭素、對(duì)羥基苯甲醛等進(jìn)行了系統(tǒng)的含量測定研究，以期為今后香莢蘭豆原料的質(zhì)量控制提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DIONEX-ULTIMATE 3000高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；UP5200H超聲波清洗器：熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司；SartoriusCP225D電子分析天平：d=0.01mg，北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 試劑

香莢蘭豆：馬達(dá)加斯加阿諾那香莢蘭公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭Vanilla planifolia Andrews的成熟果實(shí)；對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為100719-200806；香蘭素對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為100491-200901；對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為100278-201103；香草酸對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為110776-200402；甲醇為色譜純：美國天地公司；其他所用試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 薄層鑒別

2.1 香蘭素的薄層鑒別

取本品1 g，剪碎，加乙醚20mL，置錐形瓶中密塞，超聲處理20min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴ザㄈ葜?mL，作為供試品溶液，按此法制得3批樣品，批號(hào)分別為120415、120417、120426。另取香蘭素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照中國藥典2010版薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取3批供試品溶液各4μL，對(duì)照品溶液3μL分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-濃氨水（7∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖1。

圖1 香莢蘭豆中香蘭素的薄層色譜圖Fig.1 Vanillae Fructus VanillinTLC

2.2 對(duì)羥基苯甲醛的薄層鑒別

取本品1 g，剪碎，加乙醚20mL，置錐形瓶中密塞，超聲處理20min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴ザㄈ葜?mL，作為供試品溶液，按此法制得3批樣品，批號(hào)分別為120503、120504、120509。另取對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照中國藥典2010版薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取3批供試品溶液各15μL，對(duì)照品溶液3μL分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-濃氨水（7∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖2。

圖2 香莢蘭豆中對(duì)羥基苯甲醛薄層色譜圖Fig.2 Vanillae FructusHygroxybenzaldehyde TLC

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱AgilentZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫；流速為0.8mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為275 nm；進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradientelution procedure

3.2 對(duì)照品溶液的制備

取香蘭素對(duì)照品適量，精密稱定，加75%乙醇溶液制成每1mL含香蘭素50μg的溶液，即得香蘭素對(duì)照品溶液。

取對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品適量，精密稱定，加75%乙醇溶液制成每1mL含對(duì)羥基苯甲醛2μg的溶液，即得對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取香莢蘭豆原料約1 g，剪碎，精密稱定，精密加入8倍量的75%乙醇溶液，閉塞，稱定重量，超聲提取，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液0.25mL至100mL量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）過濾，即得供試品溶液。

3.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶劑，按照3.1中色譜條件各進(jìn)樣10μL，得色譜圖（見圖3）。

圖3 香莢蘭豆（A）、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品（B）、香蘭素對(duì)照品（C）、空白溶液（D）Fig.3 TheHPLC chromatogram of vanillae fructus（A），hygroxybenzaldehyde reference substance（B），vanillin referencesubstance（C），blank solution（D）

從圖中可以看出在該條件下，香蘭素、對(duì)羥基苯甲醛與相鄰的峰基線分離度大于1.5，分離度良好，且樣品中其它組分無干擾。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取3.2中香蘭素對(duì)照品溶液8.00、10.00、12.00、14.00、16.00μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以香蘭素對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以其峰面積為縱坐標(biāo)（mAU*min），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程：Y=34.435 0X+0.324 1，r= 0.999 8。結(jié)果表明：香蘭素在0.408μg~0.816μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密吸取3.2中對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以其峰面積為縱坐標(biāo)（mAU*min），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程：Y= 290.982 5X-0.030 55，r=0.999 9。結(jié)果表明：對(duì)羥基苯甲醛在0.004μg~0.020μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2中對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，香蘭素與對(duì)羥基苯甲醛峰面積的RSD分別為1.83%、0.89%，表明儀器精密度良好。

3.5.3 穩(wěn)定性研究

取同一香莢蘭豆供試品溶液按上述色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h測定其峰面積，計(jì)算供試品溶液中香蘭素與對(duì)羥基苯甲醛峰面積的RSD分別為1.77%和2.46%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批香莢蘭豆原料樣品5份，每份約1 g，精密稱定，按“供試品溶液制備”方法項(xiàng)下操作，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，并計(jì)算含量，香蘭素及對(duì)羥基苯甲醛含量的RSD分別為2.15%和2.25 %，說明重現(xiàn)性良好。

3.5.5 加樣回收試驗(yàn)

取0.01 g本品粉末9份，每份，精密稱定，加入一定量的香蘭素對(duì)照品、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備，并按上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其回收率。香蘭素加樣回收率為100.13%，RSD%為1.75%，對(duì)羥基苯甲醛加樣回收率為99.56%，RSD%為1.20%，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，該方法加樣回收率介于95%~105%之間，準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab le2 Recovery test results

3.6 樣品的含量測定

取5批香莢蘭豆原料，按擬定的含量測定方法，分別制備供試品溶液，每批平行測定3次。并按上述方法注入液相色譜儀，測定含量。結(jié)果馬達(dá)加斯加香莢蘭豆原料中香蘭素的平均含量為7.26%，對(duì)羥基苯甲醛的平均含量為0.37%。

4 小結(jié)與討論

1）制樣方法的選擇

由于香蘭素在香莢蘭豆原料中以醛類的形式存在，因此對(duì)供試品溶液的制備條件中乙醇濃度、乙醇用量、超聲時(shí)間進(jìn)行考察，通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最終確定最佳提取制備工藝為：加入8倍量75%乙醇，超聲提取20min，相對(duì)提取完全，方便可靠。

2）流動(dòng)相的選擇

甲醇、乙腈、水（用磷酸、冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH）為用高效液相色譜法分析時(shí)常常采用的流動(dòng)相。采用甲醇-水、甲醇-乙腈-冰醋酸、乙腈-0.02%磷酸作為流動(dòng)相，在香蘭素含量測定的試驗(yàn)中采用控制變量法，在其他色譜條件相同的情況下，觀察各流動(dòng)相下的色譜圖，比較其圖譜的分離度、出峰個(gè)數(shù)、理論塔板數(shù)等，并綜合實(shí)際各項(xiàng)因素最終選取甲醇-水作為原料含量測定的流動(dòng)相。

3）在對(duì)香莢蘭豆原料中主要成分香蘭素、對(duì)羥基苯甲醛進(jìn)行含量測定的同時(shí)，對(duì)其他未知成分也進(jìn)行了定性分析。在同一分析條件下，確定保留時(shí)間為13.86、15.03min的化合物分別為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸。由于檢測出的化合物對(duì)應(yīng)的峰面積較小，含量偏低，故只對(duì)這2個(gè)化合物進(jìn)行定性分析，未進(jìn)行含量測定研究。

本實(shí)驗(yàn)建立的TLC及HPLC方法可同時(shí)測定香莢蘭豆中香蘭素與對(duì)羥基苯甲醛成分含量，針對(duì)兩個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行分析，專屬性強(qiáng)，簡便可靠，可全面地對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，為建立香莢蘭豆原藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]陳德新.香莢蘭豆專題系列之四—香莢蘭豆初級(jí)與深度加工及其應(yīng)用[J].香精香料化妝品,2006,12(6):33-37

[2]趙良.香草:餐桌新寵[J].國內(nèi)外香化信息,2005(1):18

[3]楊鹿佳.天然名貴煙草增香劑香莢蘭[J].煙草科學(xué)與技術(shù),1996, (2):13

[4]任洪濤,周斌.云南香莢蘭揮發(fā)性成分的研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科技, 2007,30(1):25-30

[5]左國營,張青,楊翰.國產(chǎn)香莢蘭豆有效成分的HPLC法測定[J].中國藥房,1996,7(5):229-230

Identification of Vanillae Fructus by TLC and Determ ination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde

LIXiao-shuang，LU Jin-qing*，DAIYi，LIANGHuan，LIYu-ling，LIQiang

（Hubei University of Chinese Medicine/Medicinal Plant Research and Development Center of Hubei Province，Wuhan 430065，Hubei，China）

Thin-layer chromatographywas introduced asquality identification for Vanillae Fructus rawmaterial and an HPLCmethod was established for the content determination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde．TLC：Themobile phasewasbutylalcohol-absolutealcohol-ammonia liquor（7∶2∶1），theultravioletdetection was carried out at 254 nm.HPLC：The separation was performed on Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）with the mobile phases of methanol-water.The flow rate was 1.0 mg/mL，the detection wavelengthswere setat275 nm and the column temperaturewasmaintained at25℃.Spots in TLCwere visible. The linear ranges of Vanillin was in a range of 0.408μg-0.816μg（r=0.999 8），the average recoverieswere 100.13%with aRSD of1.75%.The linear rangesofHydroxyben-zaldehydewasin a rangeof0.004μg-0.020μg（r=0.999 9），the average recoverieswere99.56%with a RSD of1.20%.The average contentsofVanillin and p-Hydroxyben-zaldehyde were 7.26%and 0.37%respectively．The method is simple，reliable with a good reproducibility and is applicable for the determination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde in Vanillae Fructus rawmaterial.

vanillae fructus；TLC；HPLC；vanillin；p-hydroxybenzaldehyde

2013-05-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.026

李肖爽（1990—），女（漢），碩士研究生，主要從事中藥及其天然產(chǎn)物活性成分的研究。

*通信作者：盧金清（1955—），男（漢），教授，本科，主要從事中藥及其天然產(chǎn)物活性成分的研究。