楊波，韓鳳波，楊波

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林132101；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院洮南綜合試驗站，吉林洮南137100）

AB-8和D-101大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖

楊波1，韓鳳波1，楊波2

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林132101；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院洮南綜合試驗站，吉林洮南137100）

以葡萄糖為標準品，利用大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖，結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖的最佳上樣濃度為1.0mg/mL，最佳洗脫濃度為75%乙醇，最佳流速為1.0mL/min，洗脫液體積為上樣的10BV，玉竹粗多糖的純度從65.23%提高到78.64%；D-101大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖的最佳上樣濃度為0.6mg/mL，最佳洗脫濃度為50%乙醇，最佳流速為1.0mL/min，洗脫液體積為上樣的10.5BV，玉竹粗多糖的純度從65.23%提高到73.79%。AB-8大孔吸附樹脂對玉竹多糖的分離純化效果優(yōu)于D-101大孔吸附樹脂。

玉竹多糖；分離純化；AB-8大孔吸附樹脂；D-101大孔吸附樹脂

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill）Druce）為百合科多年生草本植物，主要分布于我國的東北、華北、內(nèi)蒙、西北等地，干燥根莖入藥[1]。最早以萎蕤之名載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國常用中藥材。性平，味甘，具有養(yǎng)陰潤燥、生津止渴的功能。用于熱病口燥咽干、干咳少痰、心煩心悸、糖尿病等。研究表明，玉竹的醇提物能增強免疫力，煎劑有擴張冠脈、抗急性心肌缺血、降壓、抗衰老、抗菌作用，注射液有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤作用[2]。除作藥用外，在沿海一帶和東南亞國家還作為食品、飲料、保健品、化妝品與美容[3]。目前從玉竹中已經(jīng)分離鑒定了甾體皂苷、黃酮、生物堿、多糖、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強心苷等多類成分[4]。

玉竹多糖是玉竹中主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理實驗研究表明其具有明顯的生理活性，具有抗腫瘤[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等作用，因此開發(fā)玉竹多糖具有重要意義。玉竹多糖的提取工藝已經(jīng)有很多文獻報道，但是對玉竹多糖的分離純化研究尚未見報道。常用的分離純化方法有Tca法、Sevag法[8]、酶法、Sevag法和酶法并用[9]；但是效果一般，而且無法廣泛推廣，不適于工業(yè)生產(chǎn)。

大孔樹脂法作為一種常用的分離純化方法，因其具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生簡便等優(yōu)點，因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[10-17]。本文通過D101和AB-8兩種大孔樹脂從玉竹中分離純化了玉竹多糖，對其吸附性能進行比較，選用不同濃度的多糖溶液考察靜態(tài)吸附率，解吸率，選擇最佳洗脫濃度和洗脫流速，選擇最佳純化工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)和進一步開發(fā)利用提供理論參考，具有現(xiàn)實意義。

1 材料

玉竹采自吉林農(nóng)業(yè)科技學院藥植園；AB-8型、D-101型大孔吸附樹脂：西安藍曉科技新材料股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 粗多糖的提取

將玉竹粉碎稱取450 g加2 700mL水，80℃恒溫提取1 h，浸提3次合并提取液，濃縮至300mL，用無水乙醇2 700mL沉淀12 h，過濾，沉淀烘干至恒重，得到粗多糖干粉。

2.2 標準曲線的制備

葡萄糖對照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖6.0mg，加蒸餾水定容至100mL容量瓶中，搖勻，即得0.06mg/mL的葡萄糖標準溶液。

精密量取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于小試管中，分別加蒸餾水補足至2.0mL，再分別加入苯酚溶液1.0mL，快速滴加濃硫酸溶液7mL，充分搖勻，放置使其充分反應，另以蒸餾水2.0mL加入苯酚試液和濃硫酸同上操作作為空白，40℃水浴30min，再冰浴5min。紫外可見分光光度計，在490 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線。

2.3 粗多糖純度的測定

取0.183 2 g粗多糖置于500mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取2mL多糖溶液按照2.2的方法測定吸光度，計算純度。

2.4 大孔吸附樹脂的預處理

稱取AB-8和D-101大孔吸附樹脂各200 g，用蒸餾水充分淋洗，除去表面雜質(zhì)，再用無水乙醇浸泡24 h，充分溶脹。棄去無水乙醇，用蒸餾水沖洗至無醇味，然后用4%HCl溶液浸泡3 h，蒸餾水洗至中性，再用4%NaOH溶液浸泡3 h，蒸餾水洗至中性，備用。

2.5 AB-8大孔吸附樹脂工藝條件考察

2.5.1 AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)飽和吸附率考察

2.5.1.1 樣品液制備

稱取7.692 3 g粗多糖置于500mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度（15.836mg/mL），按需要稀釋成不同濃度，備用。

2.5.1.2 靜態(tài)吸附考察

稱取10mL的AB-8大孔吸附樹脂置于50mL的錐形瓶中，充分搖勻，分別用10、5、2.5、1.5、1.0、0.6、0.5mg/mL的多糖溶液10mL進行靜態(tài)吸附，濾出上清液，以molish反應檢測，觀察上清液中是否有糖的存在，重復3次，確定上樣濃度。

2.5.2 AB-8大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附

用2.5.1實驗得到的最佳上樣濃度10mL上柱，以不同濃度的乙醇洗脫液50mL進行洗脫，流速控制在1.0mL/min，收集洗脫液，重復3次，測吸光度，考察動態(tài)吸附率。

2.5.3 AB-8大孔吸附樹脂最佳流速的選擇

用2.5.1實驗得到的最佳上樣濃度10mL上柱，以75%乙醇50mL，流速分別以0.5、1.0、2.0、3.0mL/min進行洗脫，重復3次，測吸光度，確定最佳流速。

2.5.4 AB-8大孔樹脂洗脫液體積的選擇

用2.5.1實驗得到的最佳上樣濃度上樣5mL，用

2.5.2 得出最佳洗脫濃度、2.5.3得到最佳洗脫流速進行洗脫，至洗脫液中molish反應陰性為止，重復3次，確定洗脫液體積。

2.6 D-101大孔吸附樹脂工藝條件考察

2.6.1 D-101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附考察

稱取10mL的D-101大孔吸附樹脂置于50mL的錐形瓶中，充分搖勻，分別用10、5、2.5、1.5、1、0.6、0.5mg/mL的多糖溶液8mL進行靜態(tài)吸附，濾出上清液，進行molish反應，觀察上清液中是否有糖的存在，重復3次，確定上樣濃度。

2.6.2 D-101大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附

用2.6.1實驗得到的最佳上樣濃度10mL進行上柱，后用不同濃度的乙醇洗脫液100mL進行洗脫，流速控制在1.0mL/min，收集洗脫液，重復3次，測吸光度，考察動態(tài)吸附率。

2.6.3 D-101大孔吸附樹脂最佳流速的選擇

用2.6.1實驗得到的最佳上樣濃度10mL進行上柱，后用50%乙醇100mL進行洗脫，流速分別控制在0.5、1.0、2.0、3.0mL/min，重復3次，測吸光度，確定最佳流速。

2.6.4 D-101大孔吸附樹脂洗脫液體積的選擇

用最佳上樣濃度上樣5mL，用最佳洗脫濃度，最佳洗脫流速進行洗脫，直至洗脫液中不發(fā)生molish反應為止，重復3次，記下洗脫液體積。

2.7 驗證試驗

量取AB-8大孔樹脂和D-101大孔樹脂各50mL裝柱，按照試驗確定的最佳工藝上樣洗脫，測量吸光度，烘干洗脫液得到烘干物的質(zhì)量，按照2.3法測定含量，重復3次，考察工藝穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖的提取量

通過2.1的提取方法進行提取、沉淀、烘干、精密稱定，40.905 4 g，提取率為6.84%。

3.2 標準曲線的制備

由2.2的實驗方法繪制標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 G lucose standard curve

由圖1可以看出：濃度在0.0194mg/mL~0.097mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

3.3 粗多糖干粉的純度

按照2.3的多糖測定方法測定其吸光度為0.606、0.605、0.607，計算粗多糖的純度為65.229%。

3.4 確定最佳上樣濃度

通過2.5.1和2.6.1的實驗方法得到以下結(jié)果，顯示洗脫液中是否有多糖。由表1選擇出AB-8大孔吸附樹脂的最佳上樣濃度為1.0mg/mL，D-101大孔吸附樹脂的最佳上樣濃度為0.6mg/mL。

表1 靜態(tài)吸附Table1 Static adsorption

3.5 洗脫液最佳濃度確定

按照不同濃度洗脫樹脂，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度洗脫液的吸光度Fig.2 Eluentabsorbanceat different concentrations

由圖2可知AB-8大孔吸附樹脂洗脫液的吸光度隨著乙醇的濃度的增加而增加，但是增加不大，為考慮節(jié)省實驗材料所以選擇75%的乙醇為最佳洗脫濃度，D-101大孔吸附樹脂洗脫液的最佳濃度為50%的乙醇。

3.6 確定最佳洗脫流速

通過2.5.3和2.6.3的實驗方法得到以下結(jié)果。

圖3 洗脫液不同流速的吸光度Fig.3 Eluentabsorbanceat different flow speed

由圖3可知吸光度隨著流速的增加而減小，也就是洗脫率隨著流速的增加而減小，但是當流速為0.5mL/min和1.0mL/min時，這兩種樹脂洗脫液的吸光度均沒有變化，并都在最高值，考慮到流速過慢，會影響實驗進程和生產(chǎn)效率，所以最佳流速選擇1.0mL/min。

3.7 選擇洗脫體積

通過2.5.4和2.6.4的實驗方法得到以下結(jié)果。

圖4 兩種樹脂洗脫體積Fig.4 Two resinselution volume

由圖4計算得AB-8大孔吸附樹脂洗脫液體積為49.3mL，D-101大孔吸附樹脂洗脫液體積為53.3mL。在試驗中為使多糖盡量洗脫下來，所以選擇AB-8大孔吸附樹脂洗脫液體積為10 BV體積，D-101大孔吸附樹脂洗脫液體積為10.5BV。

3.8 玉竹多糖純化

通過2.7的實驗方法測得吸光度見表2、表3。

表2 洗脫液的吸光度Table2 Eluentabsorbance

表3 烘干物質(zhì)量Table3 Drym atterm ass

通過兩種樹脂對玉竹多糖的純化，AB-8大孔吸脂使玉竹多糖的純度達到78.64%，D-101大孔樹脂使玉竹多糖的純度達到73.79%。

3.9 玉竹多糖最佳純化工藝

通過以上實驗結(jié)果得出AB-8的最佳分離工藝為最佳上樣濃度為1.0mg/mL，最佳洗脫濃度為75%乙醇，最佳流速為0.5mL/min，但是0.5mL/min流速于1.0min/mL的吸光度相差不大，但是流速過慢，影響實驗進程和生產(chǎn)效率，所以最佳流速選擇1.0mL/min。最佳洗脫液體積為10BV體積，純度從65.23%提高到78.64%；D-101的最佳分離工藝為最佳上樣濃度為0.6mg/mL，最佳洗脫濃度為50%乙醇，最佳流速為1.0 mL/min，最佳洗脫液體積為10.5 BV，純度從65.23%提高到73.79%。所以AB-8大孔吸附樹脂對玉竹多糖的分離效果要優(yōu)于D-101大孔吸附樹脂。

4 結(jié)論

一般多糖的純化比較復雜，本實驗采用大孔吸附樹脂對玉竹多糖進行初步純化的研究，玉竹多糖純度達78%以上。結(jié)果表明大孔吸附樹脂可以用于玉竹多糖的純化，對玉竹多糖純化方法具有創(chuàng)新性，對其它多糖類物質(zhì)精制除雜也有重要參考價值。從本文試驗結(jié)果看，樣品液經(jīng)過選用的兩種型號大孔吸附樹脂柱，玉竹多糖純度均有明顯提高。

其中AB-8型大孔吸附樹脂提高近13%，玉竹多糖純度達到78.64%，最佳分離工藝為：上樣濃度為1.0mg/mL，洗脫濃度為75%乙醇，流速為0.5mL/min，但是0.5mL/min流速與1.0min/mL的吸光度相差不大，但是流速過慢，影響實驗進程和生產(chǎn)效率，所以最佳流速選擇1.0mL/min。最佳洗脫液體積為10 BV體積；D-101型大孔吸附樹脂純度提高近8%，玉竹多糖純度達到73.79%，而且玉竹多糖過柱得收率較高。最佳分離工藝為：上樣濃度為0.6mg/mL，洗脫濃度為50%乙醇，流速為1.0mL/min，洗脫液體積為10.5 BV。因此，對玉竹多糖進行純化時，AB-8大孔吸附樹脂對玉竹多糖的分離效果優(yōu)于D-101大孔吸附樹脂，本文對玉竹多糖及其多糖類制劑開發(fā)有實際意義。

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Isolation&Purification of Polysaccharide from Polygonatum odoratum by AB-8 and D-101 M acroporous Adsorption Resins

YANGBo1，HANFeng-bo1，YANGBo2

（1.Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China；2.Taonan Integrated Test Station，Jilin Academy of Agricultural Science，Taonan 137100，Jilin，China）

Glucose is used as standerd in the experiment.AB-8macroporous adsorption resin to extract and purify polysaccharide of polygonatum odoratum.The best condition of extracting and purifying polygonatum odoratum，the best concentration for sampleswas 1.0mg/mL，the bestelution concentration was 75 percentof ethanol，the bestvelocitywas1.0mL/min，and the elution liquid volumewas10 BV.The purification degree of crude polysaccharid in polygonatum odoratum increased from 65.23%to 78.64%.However，using D-101 macroporousadsorption resin toextractand purifypolysaccharideof polygonatum odoratum.Thebestcondition of extracting and purifying polygonatum odoratum，the best concentration for samples was 0.6 mg/mL，the best elution concentrationwas50 percentofethanol，the bestvelocitywas1.0mL/min，and the elution liquid volume was10.5BV.Thepurification degreeofcrude polysaccharid in polygonatum odoratum increased from 65.23%to 73.79%.The resultshowed that the effectofextracting and purifying polysaccharide of polygonatum odoratum with AB-8macroporousadsorption resinwasbetter than D-101macroporousadsorption resin.

Polygonatum odoratum polysaccharide；purification；AB-8macroporousadsorption resin；D-101 macroporousadsorption resin

2014-07-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.018

吉林省科技項目（20130303093）

楊波（1979—），男（漢），講師，博士，主要從事園林植物的教學及研究工作。