胡 誠 王 晶 張丹妹 史榕荇 包伍葉 宋映周 盧 俊 圖 婭 鄔繼紅

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029; 2 世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會，北京，100101; 3 中日友好醫(yī)院針灸科，北京，100029)

電針對慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬CNTF Rα、EGFR蛋白表達(dá)的影響

胡 誠1王 晶2張丹妹1史榕荇3包伍葉1宋映周1盧 俊1圖 婭1鄔繼紅1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029; 2 世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會，北京，100101; 3 中日友好醫(yī)院針灸科，北京，100029)

目的：觀察電針對抑郁大鼠海馬睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(CNTF Rα)、表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達(dá)的影響，探討慢性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的改變及電針的干預(yù)作用趨勢。方法：雄性SD大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、模型+電針組、模型+氟西汀組，每組10只。利用生物素標(biāo)記蛋白芯片技術(shù)，檢測大鼠CNTF Rα、EGFR蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組與空白組比較，大鼠海馬CNTF Rα、EGFR蛋白表達(dá)上調(diào)(fold change=1.50，1.37)。模型+電針組、模型+氟西汀組與模型組比較，CNTF Rα水平下調(diào)(fold change=0.73，0.50)，EGFR表達(dá)水平下調(diào)(fold change=0.61，0.47)。結(jié)論：各組大鼠海馬CNTF Rα、EGFR的表達(dá)存在差異性，這可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能改變及針刺抗抑郁的機制之一。

電針;抑郁癥;慢性應(yīng)激;海馬;星形膠質(zhì)細(xì)胞

抑郁癥是一種常見的精神疾患，主要表現(xiàn)為顯著而持久的心境低落，思維行為改變，并伴有軀體癥狀[1]。電針治療抑郁癥可起到減輕軀體癥狀、降低抗抑郁藥物不良反應(yīng)的作用，并且針?biāo)幗Y(jié)合使用，還可使療效疊加[2]。針刺治療抑郁癥已成為臨床中的重要組成部分，顯示出了較大的優(yōu)勢，但其作用途徑較復(fù)雜，且尚沒有統(tǒng)一的定論。本研究首次利用生物素標(biāo)記蛋白芯片技術(shù)，篩選出與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能變化相關(guān)的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(CNTF Rα)、表皮生長因子受體(EGFR)，旨在豐富針刺治療抑郁癥的機制研究。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠(200±20)g，清潔級，共40只。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2004-2007。所有動物在實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗室溫度(23±1)℃、濕度55%～60%。

1.2 主要試劑和儀器電針儀 (華佗牌，SDZ-II型);氟西汀(Fluoxetine hydrochloride，法國禮來公司，批號：J20120001);AAR-BLM-1試劑盒(美國RayBiotech公司，芯片批號：4015806、4015807)：包括膜芯片(RayBio? Biotin label-based Rat antibody array 1)、標(biāo)記試劑、終止液、封閉緩沖液、紅外熒光劑—鏈霉親和素、透析管和浮漂、20X的洗液I、20X的洗液II、純化柱、孵育盒;紅外熒光掃描儀(Licor-Odyssey，美國LI-COR公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 對參考文獻的造模方法進行改進[3]。除空白組外，其余3組大鼠進行28 d各種不同的應(yīng)激刺激，包括：斷食24 h;斷水24 h;夜間光照12 h;冷水游泳(4 ℃，5 min，水深30 cm);潮濕墊料;夾尾2 min;束縛3 h。

1.3.2 動物分組 采用隨機數(shù)字表的方法將大鼠分為空白組、模型組、模型+電針組、模型+氟西汀組，每組10只?？瞻捉M動物自由攝食飲水，不接受任何刺激且群養(yǎng)。其他3組動物孤養(yǎng)，且每天進行慢性應(yīng)激造模處理。其中，模型+電針組動物每日在應(yīng)激刺激前1 h，進行電針干預(yù)。模型+氟西汀組動物每日在應(yīng)激刺激前1 h，進行氟西汀灌胃干預(yù)。

1.3.3 針刺方法 取穴：針刺穴位參考《實驗針灸學(xué)》[4]，選取“百會”“印堂”穴。操作：針具選用30號1寸毫針(2.5 cm)，平刺進針，深度為0.5～1 cm。進針后，接電針治療儀，以大鼠頭部微顫為宜，留針20 min/次。

1.3.4 給藥方法 將藥物溶于蒸餾水中，給藥容積為5 mL/kg體重，用藥劑量10 mg/kg體重。

1.4 取材及檢測方法 于慢性應(yīng)激4周后，灌流，取腦放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存待測。1)樣品透析：將每組的10個大鼠海馬組織混合，取200 μL組織裂解液加入透析管中，然后在4 000 mL的1×PBS(pH=8)中4 ℃邊攪拌邊透析。更換透析液1次/3 h。2)測定蛋白濃度：采用BCA試劑盒(Pierce公司，貨號：23227)檢測淋巴液蛋白濃度。3)生物素標(biāo)記：將標(biāo)記試劑小管快速離心，管中加入500 μL 1×PBS溶解粉末，上下吹打?qū)?biāo)記試劑混勻，制備成1×標(biāo)記試劑溶液;向新的離心管中加入適當(dāng)量的標(biāo)記試劑，快速混勻，此后，每5 min輕彈離心管以混合反應(yīng)試劑，搖床上室溫孵育30 min;加入5 μL終止液，用純化柱去除未與芯片上蛋白結(jié)合的生物素;將柱子放入50 mL收集管中;于3 000 r/min離心機離心3 min，去掉儲存液，重復(fù)兩次此操作后，清洗干凈柱子;將柱子放入一個新的50 mL離心管中，緩慢將標(biāo)記好的樣品加入樹脂床的中央。4)封閉和孵育：用鑷子拖著膜或者夾著膜的邊緣將膜緩慢浸沒到2.5 mL的封閉緩沖液中，有標(biāo)志的面朝上，避免氣泡產(chǎn)生，蓋上孵育盒的蓋子，室溫振蕩孵育1 h;用抽液泵抽去封閉液，每張膜芯片加入2.5 mL封閉液稀釋好的樣品，蓋上蓋子，包上塑料薄膜，4 ℃環(huán)境下過夜;抽去樣品，每個孵育盒中加入約3 mL的1×洗液I(20×洗液用去離子水稀釋)室溫振蕩洗膜，洗膜4次，5 min/次;抽去1×洗液I，加入1×洗液II室溫振蕩洗膜，洗膜3次，5 min/次;抽去1×洗液II，每張膜加入2.5 mL用封閉液8 000倍稀釋的CW800-鏈霉親和素;室溫避光振蕩孵育2 h;洗膜(步驟同上)。5)掃描：使用美國LI-COR公司的LI-COR Odyssey Scanner進行掃描，設(shè)定波長為800掃描通道，掃描強度intensity為7.0，分辨率為42 μm。采用儀器自帶分析軟件提取數(shù)據(jù)，采用AAR-BLM-1的數(shù)據(jù)分析軟件來進行數(shù)據(jù)預(yù)分析。

2 結(jié)果

4周應(yīng)激處理后，與空白組相比，模型組大鼠海馬CNTF Rα表達(dá)上調(diào)(fold change=1.50);相較于模型組，模型+電針組、模型+氟西汀組CNTF Rα表達(dá)下調(diào)(fold change=0.73，0.50)。見圖1。

圖1 各組海馬CNTF Rα的表達(dá)

與空白組相比，模型組大鼠海馬EGFR蛋白的表達(dá)上調(diào)(fold change=1.37);與模型組相比，模型+電針組、模型+氟西汀組EGFR表達(dá)下調(diào)(fold change=0.47)。見圖2。

圖2 各組海馬EGFR的表達(dá)

3 討論

3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞與抑郁癥 星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AST)，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣的一類細(xì)胞，是神經(jīng)元的支持細(xì)胞。在突觸重塑、神經(jīng)細(xì)胞再生、神經(jīng)元調(diào)節(jié)方面，AST也起著重要的作用[5]。AST與情緒障礙性疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。Czeh等[6]對成年雄性樹鼩進行5周心理應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)其海馬AST總數(shù)減少，胞體體積減小。Lori L[7]等用磁共振成像技術(shù)觀察包括抑郁障礙的情緒障礙性疾病患者，發(fā)現(xiàn)其星型膠質(zhì)細(xì)胞密度減少。AST在腦損傷中起著雙重作用。郭志慧等[8]認(rèn)為，腦組織受損后釋放多種因子激活了AST，而活化的AST在早期對神經(jīng)元有保護作用，另一方面，也通過釋放多種損傷因子對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性。姜碩等[9]建立抑郁大鼠模型并用針刺治療發(fā)現(xiàn)，模型大鼠AST明顯減少，針刺干預(yù)后AST增多。

3.2 關(guān)于指標(biāo)的選擇 生物素標(biāo)記蛋白芯片技術(shù)具有實用性強、快速、準(zhǔn)確、高通量、高靈敏度等特點[10]。彌補了基因組研究不能獲得對疾病狀態(tài)進行了解的缺陷。本課題應(yīng)用生物素標(biāo)記蛋白芯片技術(shù)，共檢測出大鼠90個蛋白的表達(dá)情況。著重關(guān)注了CNTF Rα和EGFR兩個指標(biāo)。CNTF Rα是睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)的特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。KAHN等[11]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的AST表面均有CNTF受體的表達(dá)。EGFR具有絡(luò)氨酸激酶活性。有研究表明[8]，AST活化后，EGFR表達(dá)明顯上調(diào)，而抑制EGFR會抑制AST的活化。此外，何健等[12]認(rèn)為，AST被激活后，細(xì)胞表面的CNTF Rα、EGFR超表達(dá)，通過改善復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，有利于定向誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。這對進一步探討抑郁狀態(tài)下AST功能的變化及針刺干預(yù)的影響，完善針刺抗抑郁的機制研究有著重要的意義。

通過檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)研究多重復(fù)AST特異性標(biāo)記物膠原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)與AST功能的關(guān)系，而少有其他相關(guān)蛋白的報道。生物素標(biāo)記蛋白芯片技術(shù)為我們提示了CNTF Rα、EGFR蛋白差異性變化的趨勢，但對于所篩選的蛋白的可靠性和二者的作用及影響機制，還有待實驗和臨床的進一步驗證和完善。

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(2014-02-12收稿 責(zé)任編輯：王明)

Influence of Electro-acupuncture on CNTF Rα、EGFR protein expression in rats with chronic stress depression

Hu Cheng1，Wang Jing2，Zhang Danmei1，Shi Rongxing2，Bao Wuye1，Song Yingzhou1，Lu Jun1，Tu Ya1，Wu Jihong1

(1SchoolofAcu-moxibustionandTuina，BeijingUniversityofChinesemedicine，Beijing100029，China;2WorldFederationofChinesemedicineSocieties，Beijing100101，China; 3China-JapanFriendshipHospital，Beijing100029，China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture on ciliary neurotrophic factor receptor and epidermal growth factor receptor of the hippocampal in the depression model rats.Methods：SD rats were randomly divided into four groups： blank group，model group，model+EA group，and model+ fluoxetine.Use biotin-labeled protein chip technology to detect the expression of CNTF Rα and EGFR.Results：Compared to the blank group，the protein expression of CNTF Rα and EGFR in the model group are upregulation.Compared to the model group，CNTF Rα and EGFR expression are downregulation in model+EA group and model+ fluoxetine group.Conclusion：The different expression of CNTF Rα and EGFR in each group may be one of the mechanisms of antidepressant by acupuncture.

Electro-acupuncture;Depression;Chronic Stress;Hippocampus;Astrocyte

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：81173334);北京中醫(yī)藥大學(xué)2013年校級自主課題(編號：0100604217)

鄔繼紅(1964.4—)，女，碩士研究生，教授，研究方向：影響針灸療效相關(guān)因素的研究，E-mail：wujihong@sohu.com

R245.9+7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.05.024