王燁珣，何 娟

多索茶堿對(duì)體外U937細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的影響

王燁珣1，2，何 娟1

目的探討磷酸二酯酶抑制藥多索茶堿對(duì)體外培養(yǎng)的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細(xì)胞U937增殖及凋亡的影響。方法分別將不同實(shí)驗(yàn)濃度的多索茶堿作用于一定濃度的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，采用WST-1方法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性受抑程度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加而逐漸增加(P<0.01)，其中以60 mg/L組最明顯。不同濃度的多索茶堿均能促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，且凋亡具有顯著的濃度依賴性及時(shí)間依賴性(P<0.01)。結(jié)論多索茶堿能夠抑制白血病細(xì)胞U937細(xì)胞株增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并具有濃度及時(shí)間依賴性。

多索茶堿；髓系白血??；U937細(xì)胞；細(xì)胞增殖與凋亡

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一些化療藥物殺滅白血病細(xì)胞的主要機(jī)制[1-3]。多索茶堿屬于磷酸二酯酶抑制藥(PDE)，國(guó)內(nèi)外均有研究提示茶堿類藥物有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4-7]。本研究擬將多索茶堿作用于U937細(xì)胞，觀察對(duì)其增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 多索茶堿(開(kāi)封康諾藥業(yè)公司生產(chǎn)，應(yīng)用時(shí)配至實(shí)驗(yàn)所需濃度)；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，一抗。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒及FITC綠色熒光標(biāo)記。光學(xué)顯微鏡，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。數(shù)碼顯微鏡(OLYMPUS BX41型)，生物顯微鏡(CHA型)，Leica Q550CW圖象采集和分析系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司)，微量移液器。脫水機(jī)(LEICA300型)，石蠟包埋機(jī)(EG1150型)，切片機(jī)(LEICA RM2235型)。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人-粒單核性白血病細(xì)胞株U937購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)血液室，將購(gòu)入后的U-937細(xì)胞置于培養(yǎng)液常規(guī)飼養(yǎng)，每日更換新鮮培養(yǎng)液，隔日傳代。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

培養(yǎng)液配置：無(wú)菌的RPMI1640培養(yǎng)液500 ml，加入胎牛血清(無(wú)菌 ，去除支原體)50 ml，加入青霉素濃度為10 000 U/ml和鏈霉素濃度為10 mg/ml的混合液5 ml。混勻后，分裝至100 ml的試劑瓶中，4 ℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 WST-1法檢測(cè)多索茶堿對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×104/ml，將待測(cè)細(xì)胞吹勻后接種于96孔板，每孔90 μl，然后分別加入多索茶堿液10 μl，其實(shí)驗(yàn)終濃度分別設(shè)5.0、10.0、15.0、30.0、60.0 mg/L，另設(shè)空白對(duì)照孔。每個(gè)濃度設(shè)定10個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組只加含10%小牛血清的RPMI1640，將各組分別在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h及24 h。取出培養(yǎng)后的培養(yǎng)板，每孔加WST-1溶液10 μl混勻，37 ℃再培養(yǎng)2 h，將培養(yǎng)板取出，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇450 nm和 620 nm波長(zhǎng)，分別測(cè)定每孔的吸光度值，相減后得到調(diào)整后的OD450，再用無(wú)細(xì)胞孔校正。

1.4 TUNEL法檢測(cè)多索茶堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 (1)培養(yǎng)步驟同上，取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，進(jìn)行藥物干預(yù),以5×104/ml的細(xì)胞濃度接種于瓶?jī)?nèi)，分別加入多索茶堿溶液500 μl，其實(shí)驗(yàn)終濃度分別設(shè)為10.0、20.0、30.0 mg/L，對(duì)照組不加，各組分別于培養(yǎng)12 h及24 h時(shí)分別收集細(xì)胞制備涂片用于凋亡檢測(cè)。(2)將固定好的細(xì)胞涂片以下述流程處理：PBS漂洗兩次，樣本周?chē)梦埼桑總€(gè)樣本加50 μl TdT酶反應(yīng)溶液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min(TdT酶反應(yīng)溶液：45 μl Equilibration Buffer+1μl FITC-12-dUTP+4 μl TdT Enzyme,需新鮮配制)，陰性對(duì)照片不加TdT酶，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡檢測(cè)：激發(fā)波450～500 nm ,發(fā)射波長(zhǎng)515～565 nm(綠)。(3)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)，結(jié)果判斷：在清晰的背景上細(xì)胞呈黃綠色為陽(yáng)性。每張片子連續(xù)選取5個(gè)互不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以平均數(shù)記為該片陽(yáng)性細(xì)胞凋亡數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 多索茶堿對(duì)U937細(xì)胞的增殖抑制作用 空白對(duì)照組細(xì)胞增殖活性(OD值)為0.404±0.016，不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細(xì)胞12 h及24 h后，細(xì)胞增殖活性受抑程度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加而逐漸增加(P<0.01)，其中以60 mg/L作用24 h組最明顯(表1)。

表1 多索茶堿濃度、作用時(shí)間與細(xì)胞增殖活性(OD值)檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系 (n=10；

2.2 多索茶堿對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響 WST-1法與TUNEL法所觀察結(jié)果一致，空白對(duì)照組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(7.8±1.3)個(gè)，3組不同濃度的多索茶堿作用12 h及24 h均能促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，且凋亡具有顯著的濃度依賴性(P<0.01)及時(shí)間依賴性(P<0.01)，見(jiàn)表2。凋亡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 多索茶堿濃度、作用時(shí)間與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系 (n=5；

圖1 多索茶堿作用后電鏡下細(xì)胞凋亡狀況(FITC，×200倍)

3 討 論

近年來(lái),隨著聯(lián)合化療的應(yīng)用及有效化療方案的不斷改進(jìn)和完善，成人急性白血病的完全緩解率可達(dá)70%以上，但其長(zhǎng)期生存率只有10%～40%[1，2]。研究表明, 各種白血病的發(fā)生及其對(duì)治療的反應(yīng)可能均和白血病細(xì)胞凋亡的減少有關(guān)，這也成為如何通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡來(lái)治療白血病的重要著力點(diǎn)。Li等[3]在對(duì)白血病細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞的增殖與凋亡在病理狀態(tài)下穩(wěn)定在一定比例上, 如何破壞這種比例加速白血病細(xì)胞凋亡將成為篩選和尋找新的化療藥物的重點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外均有研究提示，茶堿類藥物有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。如Binet等[4]發(fā)現(xiàn)氨茶堿能誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病患者B淋巴細(xì)胞凋亡；劉澤林等[5]報(bào)道磷酸二酯酶抑制藥對(duì)淋巴瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；趙蘭濱等[6]報(bào)道氨茶堿誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡；羅亞玲等[7]報(bào)道氨茶堿能誘導(dǎo)人氣管平滑肌細(xì)胞凋亡。多索茶堿亦屬于茶堿類藥物，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

磷酸二酯酶抑制藥多索茶堿是第二信使分子(cAMP)環(huán)核苷酸信號(hào)滅活的關(guān)鍵酶，可調(diào)控體內(nèi)cAMP濃度，進(jìn)一步激活其效應(yīng)分子蛋白激酶A(PKA)，降低細(xì)胞生長(zhǎng)的速度，抑制細(xì)胞的增殖，同時(shí)還可通過(guò)激活核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。多索茶堿還具有增加兒茶酚胺，調(diào)節(jié)鈣流及拮抗腺苷受體作用[9]，鈣離子同屬細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的第二信使，能夠通過(guò)鈣離子蛋白受體CaM調(diào)整cAMP代謝，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的cAMP累積而進(jìn)入cAMP-PKA通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此以外，茶堿類藥物還可通過(guò)下調(diào)bcl-2[10],上調(diào)p53[11]及fas[12]誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的多索茶堿分別作用于U937細(xì)胞12 h及24 h后，細(xì)胞增殖活性受抑程度及凋亡隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加而呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性及時(shí)間依賴性。多索茶堿是目前臨床應(yīng)用比較成熟的藥物，其不良反應(yīng)及機(jī)體的耐受能力均遠(yuǎn)優(yōu)于氨茶堿，兼具經(jīng)濟(jì)性和安全性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該藥可以作為白血病治療的輔助藥物，并為其他類似藥物作用的拓展研究提供思路。

[1] Ravandi F. New treatments and strategies in acute myeloid Leukemia[J]. Clin Lymphoma My-eloma Leuk，2011，3(Suppl):60-64.

[2] Robak T, Wierzbowska A . Current and emerging therapies for acute myeloid leukemia[J]. Clin Ther, 2009，31(2):2349-2370.

[3] Li X,Gang J,Feldman E,etal. Apoopgtotic cell death during treatment of leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 1994, 13( Supple) : 65.

[4] Binet J L,Mentz F,Baudet S，etal.In vitro induction Of apoptosis in chronic lymphoid leukemia B lymphocytes by Theophylline;therapeutic applications[J].Bull Acad Natl Med,1995，179(7):1379-1391.

[5] 劉澤林，董作仁，張學(xué)軍，等.氨茶堿對(duì)淋巴瘤細(xì)胞系增殖與凋亡的影響及機(jī)制探討[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003,11(1)：45-49.

[6] 趙蘭濱，李梅君.氨茶堿對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2008，13(8)：3057-3058.

[7] 羅亞玲，賴文巖，袁 勇，等. 氨茶堿誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人氣管外平滑肌細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001,17(5):539-542.

[8] 戴 云，張 兵. 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,1998,20(6):116-121.

[9] 李 麗.多索茶堿的藥理學(xué)研究概述[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(合成藥生化藥制劑分冊(cè)),2001,5(2):100-102.

[10] Mentz F,Mossalayi M D,Ouaaz F,etal.Theophylline synergizes with chlorrambucil in inducing apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells[J].Blood,1996,88:2172-2182.

[11] Lentini A,Vidal V F,Facchiano,F ,etal.Theophylling administration markedly reduces hepatic and pulmonary implantaion of B16-F10 melanoma cells in mice[J].Melanona Res,2000,10:435-443.

[12] 李志奎，王長(zhǎng)征，錢(qián)桂生.氨茶堿對(duì)體外嗜酸粒細(xì)胞凋亡及FasmRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001,17(2)：543-545.

(2014-03-22收稿 2014-05-05修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

DoxofyllineinhibitesU937cellsproliferationandinducesapoptosisinvitro

WANG Yexun1,2and HE Juan1.

1.Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Department of Medicine, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the effects of the inhibitors of phosphodiesterase for acute myeloid leukemiainvitroculture U937 cell proliferation and apoptosis ,and provide basis for the clinical adjuvant treatment of leukemia.MethodsAdd Doxofylline of different experimental concentrations was added respectively to a certain concentration of U937 cells in ogarithmic phase. Cell proliferation rate was detected by WST-1 method and the apoptosis by TUNEL method.ResultsDifferent concentrations of doxofylline acted on U937 cells respectively. The degree of inhibition of cell proliferative activity gradually increased with prolonged action time and the increase of drug concentration(P<0.01), the most obvious among them was in 60 mg/L group. Different concentrations of doxofylline promoted U937 cell apoptosis and apoptosis with significant concentration dependence and time dependence(P<0.01).ConclusionsConfirmed by the experiment, doxo fylline can inhibit leukemia U937 cell line proliferation and induce its apoptosis,and has concentration dependence and time dependence.

doxofylline; acute myeloid leukemia; U937 cells; apoptosis and inhibition

王燁珣，碩士，主治醫(yī)師,E-mail: wang-y-x@163.com

1.110001沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科；2.110034沈陽(yáng)，武警遼寧總隊(duì)醫(yī)院門(mén)診部

何 娟，E-mail：hejuan 2006@aliiun.com

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