張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華，王 麗

·論著·

PTEN、p-Akt在肝癌組織中的表達(dá)及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華，王 麗

目的 探討抑癌基因PTEN及其下游調(diào)控因子磷酸化Akt(p-Akt)在肝癌組織中的表達(dá)，并以上皮表型E-cadherin和間質(zhì)表型Snail為標(biāo)志，研究PTEN與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在肝癌惡性進(jìn)展過(guò)程中的作用。方法 采用免疫組化EnVision法，檢測(cè)80例肝細(xì)胞肝癌組織中PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表達(dá)情況，分析PTEN與p-Akt、Snail及E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 在肝癌組織中，PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表達(dá)率分別為46.25%、42.50%、67.50%及33.75%。PTEN、E-cadherin的表達(dá)率隨著病變的進(jìn)展而降低；而p-Akt和Snail的表達(dá)模式與PTEN、E-cadherin相反，表達(dá)率隨著肝癌組織病變的進(jìn)展而升高。Spearman相關(guān)分析顯示，PTEN 的表達(dá)與p-Akt、Snail的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.696、-0.291，P<0.05)，與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.537，P<0.05)；Snail的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.464，P<0.05)。結(jié)論 肝癌的惡性進(jìn)展可能與PTEN表達(dá)缺失導(dǎo)致的PI3K/AKT通路持續(xù)活化，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生有關(guān)；以PTEN為靶點(diǎn)提高其在肝癌組織中的表達(dá)，有望成為拮抗EMT、抑制肝癌惡性進(jìn)展的新途徑。

肝癌；PTEN；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；表達(dá)

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)居我國(guó)癌癥發(fā)病率的第2位,腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)是其復(fù)發(fā)和治療失敗的重要原因。EMT是指在某些特殊條件下，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢顒?dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。EMT的過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1]，在肝癌的發(fā)展過(guò)程中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)可與癌基因C-met結(jié)合，激活PI3K-AKT信號(hào)途徑，促進(jìn)EMT的發(fā)生[2]。抑癌基因PTEN是PI3K-AKT途徑中重要的負(fù)性調(diào)控子，在肝癌中存在廣泛的缺失或表達(dá)低下。盡管有研究表明，PTEN缺失可誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT[3]，但在肝癌的研究中還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)PTEN及其在PI3K/AKT途徑中的下游調(diào)控因子磷酸化的Akt(p-Akt)在肝癌組織中的表達(dá)，并以上皮表型E-cadherin和EMT調(diào)控因子Snail為標(biāo)志，分析肝癌發(fā)展過(guò)程中PTEN與EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集筆者醫(yī)院病理科手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本蠟塊共80例，所有標(biāo)本均經(jīng)臨床病理確診為肝細(xì)胞肝癌。其中，男性患者62例，女性18例，年齡27～78歲，平均51.37歲。肝癌的病理組織分級(jí)按照WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為：高分化(Ⅰ級(jí))8 例，中分化(Ⅱ級(jí))39例，低分化(Ⅲ級(jí))28例，未分化(Ⅳ級(jí))5例。肝癌惡性進(jìn)展的臨床客觀指標(biāo)根據(jù)CLIP評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：0分6例，1分19例，2分27例，≥3分28例。將有血管侵犯、肝內(nèi)衛(wèi)星癌灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移HCC患者列為高侵襲組，反之列為低侵襲組[5]：80例中高侵襲組39例，低侵襲組41例。全部病例術(shù)前均未接受任何化療、放療或其他抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均用40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別做HE和免疫組化染色。兔抗人多克隆抗體PTEN、Snail、E-cadherin為Abcam公司產(chǎn)品，工作濃度分別為1∶100、1∶100、1∶30；兔抗人單克隆抗體p-Akt為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，工作濃度為1∶50；EnVision染色試劑盒ChemMateTM為Dako公司產(chǎn)品。

1.2 方法 采用免疫組化EnVision法。染色步驟：將切片脫蠟水化，高壓抗原修復(fù)2 min，加一抗4 ℃過(guò)夜，PBS漂洗3×5 min；二抗37 ℃孵育60 min，PBS 漂洗3×5 min；常規(guī)DAB顯色液，顯微鏡下觀察信號(hào)并終止顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以已知陽(yáng)性結(jié)果的陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，以已知陰性結(jié)果的陰性片為陰性對(duì)照，以PBS替代一抗的免疫組化染色結(jié)果為空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 PTEN的陽(yáng)性部位為細(xì)胞質(zhì)，p-Akt的陽(yáng)性部位為胞核和胞漿，E-cadherin的陽(yáng)性部位為細(xì)胞膜和少許細(xì)胞質(zhì)，Snail陽(yáng)性信號(hào)位于胞核和胞漿。判斷陽(yáng)性反應(yīng)根據(jù)以下兩個(gè)方面[6]：(1)按切片中顯色癌細(xì)胞數(shù)比例計(jì)分：0分無(wú)癌細(xì)胞顯色；1分顯色癌細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)<25%；2分顯色細(xì)胞超過(guò)切片中癌細(xì)胞總數(shù)的25%，但<50%；3分顯色細(xì)胞超過(guò)切片中癌細(xì)胞總數(shù)的50%。(2)按切片中癌細(xì)胞顯色強(qiáng)度計(jì)分：0分細(xì)胞無(wú)顯色；1 分呈淺黃色(弱染色)；2 分呈棕黃色(中等染色)；3分呈棕褐色(強(qiáng)染色)。兩項(xiàng)相加>3分記為陽(yáng)性，≤3分記為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin在肝癌組織中的表達(dá) PTEN的陽(yáng)性部位位于細(xì)胞的胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞呈巢狀或散在分布(圖1)，HCC中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率為46.25%(37/80)；p-Akt的陽(yáng)性部位為胞核和胞漿(圖2)，在HCC中p-Akt的陽(yáng)性表達(dá)率為42.50%(34/80)；Snail蛋白在HCC中以胞核和胞漿陽(yáng)性為主(圖3)，陽(yáng)性表達(dá)率為33.75%(27/80)；E-cadherin的陽(yáng)性部位為細(xì)胞膜和少許細(xì)胞質(zhì)(圖4)，陽(yáng)性表達(dá)率為67.50%(54/80)。

圖1 PTEN在HCC中的表達(dá)(EnVision ×400)

圖2 p-Akt在HCC中的表達(dá)(EnVision ×400)

圖3 Snail在HCC中的表達(dá)(EnVision ×400)

圖4 E-cadherin在HCC中的表達(dá)(EnVision ×400)

2.2 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1，可見(jiàn)PTEN蛋白的表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤直徑、CLIP評(píng)分、侵襲性及包膜情況相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。p-Akt、E-cadherin的表達(dá)亦與病理分級(jí)、腫瘤直徑、CLIP評(píng)分、侵襲性及包膜情況相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，其中p-Akt的表達(dá)率隨著病理組織級(jí)別、腫瘤直徑、CLIP評(píng)分及侵襲性的升高而表達(dá)率增高，而E-cadherin表達(dá)模式相反，隨著病理組織級(jí)別、腫瘤直徑、CLIP評(píng)分及侵襲性的升高而表達(dá)率降低，同時(shí)p-Akt在包膜不完整的腫瘤中的表達(dá)率高，而E-cadherin在包膜完整的腫瘤中的表達(dá)率高。Snail的表達(dá)與腫瘤直徑、CLIP評(píng)分、侵襲性及包膜情況相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，但與腫瘤病理分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.3 PTEN與p-Akt、Snail及E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，HCC組織中PTEN 的表達(dá)與p-Akt的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P<0.05)，與Snail的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.291，P<0.05)，與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.537，P<0.05)。而Snail的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.464，P<0.05)。

表1 HCC組織中PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

抑癌基因PTEN是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，在肝癌的研究中，已證實(shí)PTEN基因的表達(dá)缺失與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)PTEN在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN在HCC中的陽(yáng)性表達(dá)率為46.25%，其表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤直徑、CLIP評(píng)分、侵襲性及包膜情況均相關(guān)，表明PTEN的表達(dá)缺失與肝癌惡性進(jìn)展、高侵襲性相關(guān)。PTEN是PI3K/AKT途徑最強(qiáng)的負(fù)性調(diào)控子，能拮抗PI3K/AKT信號(hào)系統(tǒng)，導(dǎo)致磷酸化Akt減少，阻斷AKT活化及其下游激酶的活性。本研究對(duì)PI3K/AKT途徑中的下游調(diào)控因子——磷酸化Akt(p-Akt)的檢測(cè)也證實(shí)了這一過(guò)程： HCC組織中PTEN 的表達(dá)與p-Akt的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明在HCC組織中PTEN的表達(dá)缺失使AKT的活化失去抑制作用，活化的AKT表達(dá)增加，使PI3K/AKT通路處于持續(xù)活化狀態(tài)，造成細(xì)胞增殖加快，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

HCC的高侵襲、高轉(zhuǎn)移特性是患者生存期短、死亡率高的重要原因；在肝癌組織中，EMT也是其高侵襲、高轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。本研究通過(guò)檢測(cè)肝癌患者肝組織中上皮表型E-cadherin的表達(dá)和E-cadherin的抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E-cadherin和Snail的異常表達(dá)與肝癌惡性進(jìn)展、高侵襲性相關(guān)，表明肝癌的進(jìn)展與其上皮細(xì)胞極性的喪失、間質(zhì)特性的獲得相關(guān)。

研究表明，EMT 與多種信號(hào)通路的激活有關(guān)，其中PI3K-AKT是重要的發(fā)生途徑之一。在該通路中，活化的AKT可以通過(guò)激活E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail，進(jìn)而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，造成上皮表型的丟失和細(xì)胞間質(zhì)化的發(fā)生[2]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT通路中負(fù)性調(diào)控子PTEN的表達(dá)與肝癌組織中上皮表型E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，均隨著腫瘤惡性程度的增加而表達(dá)下降，而與間質(zhì)標(biāo)志物Snail的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)PI3K-AKT途徑參與了肝癌EMT的發(fā)生過(guò)程，PTEN的表達(dá)缺失導(dǎo)致通路持續(xù)激活是重要的因素之一。

總之，本研究結(jié)果表明肝癌的惡性進(jìn)展可能與抑癌基因PTEN的表達(dá)缺失有關(guān)，進(jìn)而使PI3K/AKT途徑中AKT的活化失去抑制作用，造成該通路持續(xù)活化，促進(jìn)了HCC惡性進(jìn)展，同時(shí)由于PI3K/AKT途徑在EMT發(fā)生中的重要作用，PTEN的表達(dá)缺失導(dǎo)致的PI3K/AKT通路活化也是腫瘤發(fā)生EMT、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)侵襲性的重要原因之一。因此，今后圍繞PTEN基因開(kāi)展肝癌的基因治療，提高腫瘤組織中PTEN的表達(dá)，有望成為抑制肝癌惡性進(jìn)展、提高患者生存率的新手段。

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Expression of PTEN and p-Akt in Hepatocelluar Carcinoma and Their Relationship with Epithelial-mesenchymal Transitions

Zhang Yong1,Tang Xiaoyu1,Li Rongqing1,Feng Xudong1,Zhang Yanhua1,Wang Li2

1.Department of Radiation Oncology,the First Affiliated Hospital to Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China,2.Department of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To investigate the expression of PTEN and p-Akt in hepatocelluar carcinoma(HCC)and the correlation between PTEN and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in HCC malignant progression.Methods Immunohistochemical Envision method was applied in detecting the expressions of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in 80 cases with HCC and the correlation among them was analyzed.Results The positive expression rate of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in HCC was 46.25%(37/80),42.50%(34/80),67.50%(54/80)and 33.75%(27/80),respectively.The expression rates of PTEN and E-cadherin decreased in HCC malignant progression while the expression rates of pAkt and Snail increased;related analysis by Spearman pointed out that there existed a negative correlation between the expression of PTEN and those of pAkt and Snail(r=-0.696 and -0.291，P<0.05),while a positive correlation between the expression of PTEN and that of E-cadherin(r=0.537，P<0.05);there existed a negative correlation between the expression of Snail and that of E-cadherin(r=-0.464，P<0.05).Conclusions The defective expression of PTEN leads to a continuous activation of PI3K/AKT pathway that further promotes the occurrence of EMT,which may be of relationship with HCC malignant progression;to increase the expression of PTEN may be a hopeful new approach in antagonizing EMT and inhibiting the malignant procession of HCC.

hepatocelluar carcinoma(HCC);PTEN;epithelial-mesenchymal transition(EMT);expression

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81201759)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2012FB210)

650032 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科(張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華)；成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科(王 麗)

王 麗，電話:0811-774212；E-mail:2001wl@163.com

R 735.7

A

1004-0188(2014)04-0349-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.001

2014-03-02)