鄧 濤，蘇 毅，付 利，范方毅，何光翠

Flud+Bu+CCNU+Ara-C預(yù)處理單倍體造血干細(xì)胞移植治療白血病13例的療效

鄧 濤，蘇 毅，付 利，范方毅，何光翠

目的 初步探討使用“氟達(dá)拉濱(Flud)+馬利蘭(Bu)+司莫司汀(CCNU)+阿糖胞苷(Ara-C)”預(yù)處理方案行異基因造血干細(xì)胞移植治療白血病的臨床療效。方法 13例患者中，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)5例，急性淋巴細(xì)胞白血病5例，急性非淋巴細(xì)胞白血病3例。預(yù)處理方案為Flud 30 mg/(m2·d)×4 d，Bu 1 mg/(kg·次)×4 d，CCNU 250 mg/m2×1 d，Ara-C 2～4 mg/m2×2 d。供者均為親緣HLA配型半相合；輸注外周血造血干細(xì)胞有核細(xì)胞數(shù)(3.5～4.5)×108/kg受體體重(中位數(shù)為4×108/kg)，骨髓有核細(xì)胞數(shù)(3.5～4.5)×108/kg受體體重(中位數(shù)為4×108/kg受體體重)。采用“ATG+環(huán)孢霉素+短療程甲氨喋呤+曉悉”預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)。前列腺素E1(PGE1)+低分子肝素鈉+丹參預(yù)防肝靜脈閉塞癥。結(jié)果 骨髓移植后全部患者重建造血，移植后骨髓嵌合及基因檢測(cè)證實(shí)患者骨髓中造血細(xì)胞為完全供者細(xì)胞植入。結(jié)論 Flud+Bu+CCNU+Ara-C預(yù)處理方案移植治療白血病療效較好，安全可行，為無(wú)HLA完全相合供者白血病患者提供了有效的治療手段。

單倍體移植；白血??；異基因；造血干細(xì)胞；移植

HLA全相合是目前造血干細(xì)胞治療白血病的最佳選擇，但目前隨著獨(dú)生子女家庭的增加，合適的供者逐步減少，單倍體造血干細(xì)胞移植成為目前治療白血病的最有效和實(shí)際的方法[1-2]。目前多數(shù)患者采用的經(jīng)典“Bu+Cy”方案行預(yù)處理，可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體主要臟器的損害以及合并感染、出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)甚至危及患者生命。我們采用“氟達(dá)拉濱(Flud)+馬利蘭(Bu)+司莫司汀(CCNU)+阿糖胞苷(Ara-C)”預(yù)處理方案對(duì)13例白血病患者進(jìn)行單倍體移植，患者安全性較高，收到較好療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 我科2009～2012年期間收治的 13例白血病患者，年齡10～50歲，其中慢性粒細(xì)胞白血病(CML)5例，急性淋巴細(xì)胞白血病5例，急性非淋巴細(xì)胞白血病3例。供者均為親緣HLA配型半相合。

1.2 方法 供者在采集前常規(guī)體檢，無(wú)傳染病。于術(shù)前3 d給予粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行外周血及骨髓造血干細(xì)胞動(dòng)員。采髓總量以骨髓及外周血干細(xì)胞有核細(xì)胞總數(shù)計(jì)，約8×108/kg受體體重。采集骨髓前間隔約7 d分兩次給予供者備自體血600～800 ml，于采集完骨髓后輸注，避免供者由于低血容量出現(xiàn)不適及其他意外。于采集完供者骨髓后第2 d行造血干細(xì)胞采集，外周血造血干細(xì)胞采集由我科實(shí)驗(yàn)室人員用Fresenius COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)(德國(guó)Fresenius集團(tuán)公司)實(shí)施。進(jìn)行造血干細(xì)胞單采時(shí)的血流速度為50～60 ml/min，多數(shù)情況下每次分離3～4 h，分離血液總?cè)莘e9～12 L。骨髓加外周血造血干細(xì)胞有核細(xì)胞數(shù)為8.0×108/kg受體體重。

1.3 預(yù)處理方案 全部患者采用“Flud+Bu+CCNU+Ara-C”預(yù)處理，均采用“清髓”移植方案，即氟達(dá)拉濱30 mg/(m2·d)×4 d，馬利蘭1 mg/(kg·次)×4 d，司莫司汀250 mg/m2×1 d，阿糖胞苷2～4 mg/m2×2 d，采用“ATG+環(huán)孢霉素+短療程甲氨喋呤+曉悉”預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)，即CSA 2.5 mg/(kg·d)，分2次靜脈注射，從預(yù)處理第1 d開始，維持血藥谷濃度在150～250 ng/ml；移植后1個(gè)月左右改為口服；MTX：15 mg/m2靜脈注射(移植后第1 d)，10 mg/m2靜脈注射(移植后第3 d、6 d、11 d)；霉酚酸酯(MMF)0.5 g口服，1次/12 h，1個(gè)月后MMF減至停用。ATG 5 mg/kg靜脈注射(移植前第5～8 d)。

1.4 其他并發(fā)癥的預(yù)防 應(yīng)用前列腺素E1(PGE1)+低分子肝素鈉+丹參預(yù)防肝靜脈阻塞綜合征(veno occlusive disease,VOD)；應(yīng)用更昔洛韋5 mg/(kg·12 h)靜脈注射[從預(yù)處理第1 d用至移植前1 d，干細(xì)胞回輸后，替換為阿昔洛韋靜脈注射，預(yù)防巨細(xì)胞病毒(CMV)感染]；用米卡芬凈預(yù)防真菌感染。根據(jù)患者血小板和血紅蛋白情況，間斷輸注輻照血小板和紅細(xì)胞，在“粒缺期”外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)<0.5×109/L時(shí)，給予皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。

1.5 植活及嵌合體分析 采用骨髓移植供體細(xì)胞DNA嵌合率檢測(cè)受者植入情況。檢測(cè)方法：患者白細(xì)胞恢復(fù)到2×109/L以上時(shí)，抽取患者骨髓。提取送檢標(biāo)本中基因組DNA，使用AB2720型PCR儀(美國(guó)AB科學(xué)儀器公司)和AmpFLSTR Identifilier試劑盒(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)擴(kuò)增送檢標(biāo)本基因組DNA，使用AB3130XL型基因測(cè)序儀(美國(guó)AB科學(xué)儀器公司)和Gene MAPPER ID V3.2軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析，根據(jù)不同個(gè)體15個(gè)STR位點(diǎn)和性染色體檢測(cè)位點(diǎn)AMEL的基因型標(biāo)志，區(qū)分供者和受者細(xì)胞，計(jì)算移植后送檢標(biāo)本中供者細(xì)胞所占比例，即供體細(xì)胞嵌合率。

對(duì)急性白血病患者進(jìn)行免疫殘留檢測(cè)，檢測(cè)惡性幼稚細(xì)胞情況，檢測(cè)方法：采用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞抗原的表達(dá)、細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒多少，從而識(shí)別正常與異常細(xì)胞。單克隆抗體和配套試劑為美國(guó)BD公司試劑，儀器采用美國(guó)BD公司FACScantoⅡ型流式細(xì)胞儀，分析采用FACSDiva軟件。

對(duì)慢粒病人進(jìn)行BCR-ABL1融合基因定量分析，檢測(cè)基因量。檢測(cè)方法：提取送檢標(biāo)本中有核細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用AB7300型熒光定量PCR儀和TaqMan探針法，定量檢測(cè)送檢標(biāo)本中目的基因和ABL1內(nèi)參基因的表達(dá)量，定量檢測(cè)結(jié)果用目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的百分比表示。本項(xiàng)目對(duì)目的基因和內(nèi)參基因ABL1的檢測(cè)靈敏度為5拷貝/反應(yīng)體系。

2 結(jié)果

2.1 移植后造血重建及患者的生存狀況(表1) 全部患者重建造血，8例急性白血病患者中，5例經(jīng)白血病細(xì)胞微小殘留病灶監(jiān)測(cè)為0，至今無(wú)疾病復(fù)發(fā)；3例(疾病復(fù)發(fā)狀態(tài)下行挽救性移植)在接受單倍體造血干細(xì)胞移植后第90 d復(fù)查骨髓涂片和流式細(xì)胞儀分析，證實(shí)為白血病復(fù)發(fā)。其中1例患者給予供者淋巴細(xì)胞輸注后出現(xiàn)Ⅲ度急性GVHD，經(jīng)抗排斥治療后效果欠佳死亡；2例復(fù)發(fā)患者于移植后第120 d和140 d死于白血病復(fù)發(fā)后出現(xiàn)的顱內(nèi)出血。對(duì)5例CML患者移植后BCR-ABL1融合基因定量檢測(cè)。其中3例檢測(cè)BCR-ABL1融合基因定量為0，至今無(wú)疾病復(fù)發(fā)。其他2例術(shù)后檢測(cè)嵌合率為0，于骨髓移植后第180 d復(fù)查BCR-ABL1融合基因定量為150%，經(jīng)多次給予供者淋巴細(xì)胞輸注后，嵌合恢復(fù)為100%；另外1例經(jīng)供者淋巴細(xì)胞多次輸注后仍然無(wú)效，供者細(xì)胞被徹底排掉。

2.2 移植相關(guān)不良反應(yīng)及并發(fā)癥(表2) 所有移植患者均未發(fā)生腎功能損害，未發(fā)生出血性膀胱炎、重癥感染或出血、VOD、間質(zhì)性肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。6例患者在移植預(yù)處理后出現(xiàn)輕～中度口腔黏膜炎癥及潰瘍，經(jīng)加強(qiáng)護(hù)理，應(yīng)用抑酸及黏膜保護(hù)劑等1 w左右癥狀消失。均出現(xiàn)不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高，經(jīng)保肝藥物治療后均恢復(fù)正常。2例患者在骨髓移植后第5 d及第8 d出現(xiàn)肺部真菌感染，加用伏立康唑抗真菌治療后，患者肺部真菌感染控制。

表1 單倍體造血干細(xì)胞移植患者一般情況及植入情況

表2 單倍體造血干細(xì)胞移植患者并發(fā)癥情況

3 討論

異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)預(yù)處理的目的是清除體內(nèi)原有的造血細(xì)胞，最大限度地殺滅白血病或腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抑制受者的免疫，從而保證供者健康造血干細(xì)胞的植入，以達(dá)到造血和免疫系統(tǒng)的重建。因而預(yù)處理過程常采取超大劑量的放、化療。經(jīng)典的“清髓”移植方案如Thomas[3]提出的全身照射TBI 1200 cGy+環(huán)磷酰胺60 mg/(kg·d)×2 d及Santos提出的馬利蘭4 mg/(kg·d)×4 d+環(huán)磷酰胺50 mg/(kg·d)×4 d(Bu/Cy)預(yù)處理，都可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體主要臟器的損害以及合并感染、出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)甚至危及患者生命。文獻(xiàn)報(bào)道，常規(guī)的Bu/Cy預(yù)處理相關(guān)并發(fā)癥高達(dá)20%～50%，并隨受者年齡的增大而增加[4-5]。降低預(yù)處理的強(qiáng)度，利用移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效應(yīng)減少白血病復(fù)發(fā)的“小移植(mini transplantation)”或稱“非清髓移植(non myeloablative transplantation)”方案能減少預(yù)處理有關(guān)的死亡率，但與經(jīng)典方案[7-8]相比白血病的復(fù)發(fā)率增加。本研究結(jié)果顯示，采用“Flud+Bu+CCNU+Ara-C”預(yù)處理方案，對(duì)13例白血病患者進(jìn)行單倍體移植后，所有患者術(shù)后骨髓移植供體細(xì)胞DNA嵌合率檢測(cè)為100%植入。全部患者未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的急性GVHD，患者臟器功能未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p害，并且患者口腔黏膜炎及消化道潰瘍及感染發(fā)生率較Santos[6]提出的傳統(tǒng)Bu+Cy預(yù)處理方案有較明顯減低。提示對(duì)親緣間HLA半相合患者應(yīng)用本預(yù)處理方案進(jìn)行移植治療，植入率高，GVHD發(fā)生率低，安全可行，療效較好。但遠(yuǎn)期療效尚待觀察。

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610083 成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院血液科

R 733.7

A

1004-0188(2014)02-0181-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.024

2013-06-08)