張 明，宋錦寧，李 宇，趙永林，李丹東，吳 媛，付宙鋒，張斌飛

(西安交通大學醫(yī)學院：1.第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710004；2.第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；3.第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，陜西西安 710004)

◇專題研究◇

高表達瞬時電位受體通道1在大鼠彌漫性軸索損傷中的作用機制

張 明1,2，宋錦寧2，李 宇2，趙永林2，李丹東2，吳 媛3，付宙鋒2，張斌飛2

(西安交通大學醫(yī)學院：1.第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710004；2.第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；3.第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，陜西西安 710004)

目的 研究瞬時電位受體通道1(TRPC1)在彌漫性軸索損傷(DAI)中的作用，探討TRPC1在DAI后神經(jīng)元鈣超載及髓鞘變性中的機制。方法 瞬間旋轉(zhuǎn)損傷法建立大鼠DAI模型，用SKF96365干擾TRPC1通道活性后建立DAI干預組，F(xiàn)ura-2AM檢測胞內(nèi)Ca2+濃度，Western blot和免疫組化檢測皮層TRPC1蛋白的動態(tài)表達，并與正常組、DMSO對照組相比較，電鏡檢測神經(jīng)元及髓鞘改變，TUNEL檢測皮層神經(jīng)元凋亡。單因素方差分析數(shù)據(jù)。結果 DAI后皮層中TRPC1蛋白表達升高，在1 d達到高峰，隨后逐漸下降，同時皮層神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+濃度在1 d達到峰值，髓鞘結構破壞。給予TRPC1通道阻斷劑SKF96365后，皮層TRPC1蛋白表達被抑制，皮層神經(jīng)元鈣內(nèi)流減低，髓鞘結構部分保留，神經(jīng)功能評分改善。結論 DAI后TRPC1導致的鈣超載是造成髓鞘變性及神經(jīng)元死亡的重要原因，抑制TRPC1產(chǎn)生的鈣內(nèi)流可保護髓鞘結構完整，減輕神經(jīng)元凋亡。

瞬時電位受體通道1(TRPC1)；彌漫性軸索損傷；髓鞘變性；鈣超載；神經(jīng)元凋亡

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是目前國內(nèi)外造成各類年齡段人群高致殘率和高死亡率的首要原因，對患者及其家庭造成沉重的社會及經(jīng)濟壓力。TBI后神經(jīng)病理改變多種多樣，其中最嚴重的是彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)[1]。DAI可反映在機械負荷下頭部的加速性損傷造成選擇性大腦白質(zhì)軸突水腫、軸索斷裂等改變。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元再生能力有限，且在臨床中觀察到軸突損傷后致殘率較高，因此軸突變性的發(fā)病機制研究變得尤為重要。有研究報道軸突外Ca2+可能來源于“軸漿池”或胞外鈣庫，這些Ca2+離子通道被位于神經(jīng)纖維節(jié)間的多分子復合物或質(zhì)膜上的離子通道所調(diào)控[2-3]，其過度激活可誘發(fā)鈣庫或鈣池釋放出過量Ca2+而導致神經(jīng)損傷。瞬時受體電位離子通道C1(canonical transient receptor potential channel 1, TRPC1)在質(zhì)膜Ca2+轉(zhuǎn)運中起重要作用，而其在DAI后軸突損傷中的作用尚不明確。本研究采用瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型建立大鼠DAI模型，初步探討TRPC1離子通道在軸索損傷及神經(jīng)元鈣超載中的作用，揭示TRPC1參與DAI后神經(jīng)損傷機制，尋找臨床干預的新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 SPF級具有相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量250～300 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(陜)08-018)。SKF96365(S7809, Sigma-Aldrich，美國)；二甲基亞砜溶液(DMSO，D8418，Sigma-Aldrich，美國)；細胞膜蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific，美國)；TRPC1兔單克隆抗體(Abcam，美國)；NeuN(Chemicon, MAB377B，美國)；β-actin鼠單克隆抗體(Santa Cruz，美國)；辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(Santa Cruz，美國)；PVDF膜(Millipore，美國)；TUNEL凋亡試劑盒(Promega, 美國)；凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A，中國)；圖像采集與分析系統(tǒng)(Leica-Q550CW，德國)；透射式電子顯微鏡(H-600型；HITACHI，日本)；SPSS 18.0統(tǒng)計軟件(美國)；腦立體定向儀(西安交通大學醫(yī)學院人體解剖學教研室提供)。

1.2 實驗動物分組 隨機分為DAI模型組30只，SKF96365干預模型組30只，DMSO干預對照模型組5只，正常對照組5只。DAI模型組及SKF96365干預模型組各分為5個亞組，分別為：1、3、5、7、10 d組各6只。

1.3 大鼠DAI模型的建立及分組處理 采用瞬間旋轉(zhuǎn)損傷法建立大鼠DAI模型[4]。大鼠術前禁食禁飲6 h，100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量為0.2 mL/100 g。麻醉成功后將其俯臥位固定于旋轉(zhuǎn)平臺，即大鼠頭部由固定雙側(cè)外耳道的耳棒、頭夾及前磨牙固定孔共同固定于外側(cè)頭的旋轉(zhuǎn)裝置，而大鼠身體則與固定平臺呈30°夾角。按下旋轉(zhuǎn)開關后，大鼠頭部迅速旋轉(zhuǎn)90°停止，此過程包含加速及減速運動。之后復位裝置，重復致傷過程8次。SKF96365干預模型組使用TRPC1通道阻斷劑SKF96365 5 μL溶于DMSO，終濃度為10 μmol/L，于造模前30 min經(jīng)立體定向側(cè)腦室注射(前囟后1 mm，旁開1.5 mm，深3.5 mm)，其他操作與DAI組相同；DMSO干預模型組使用等量DMSO行側(cè)腦室注射，其他操作與DAI組相同；正常對照組不予任何處理。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 根據(jù)改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity score, mNSS)法[5]對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分。主要包括運動實驗、感覺實驗、平衡木實驗、反射喪失及不正常運動，其中運動實驗包括提尾實驗及平地運動實驗，感覺實驗包括放置實驗和本體感覺實驗，反射及不正常運動包括耳廓反射、角膜反射、驚恐反射及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙。

1.5 HE染色、免疫組化染色及電鏡標本采集 所有大鼠飼養(yǎng)到對應時間后，用100 g/L水合氯醛以0.5 mL/kg麻醉，剪開胸腔，剝開心包膜，暴露心臟，將下腔靜脈和腹主動脈用動脈夾夾閉，剪開左心室將灌注頭插入主動脈然后用動脈夾固定，剪開右心耳放出血液，用生理鹽水快速將血管內(nèi)的血沖洗干凈，再注入40 g/L的多聚甲醛固定液500 mL灌流固定。之后取腦用石蠟包埋，并制成5 μm切片，采用HE法及SABC法進行組織化學染色并在光鏡下進行觀察。在處理電鏡組織標本的時候，生理鹽水灌注如前，再用25 mL/L的戊二醛固定液1 000 mL灌注固定，將皮層固定于電鏡固定液中，待制作電鏡標本。透射電鏡標本：將皮層標本用電鏡固定液固定，采用常規(guī)電鏡標本制作方法，經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋和修塊后作超薄切片，在透射電鏡下觀察。

1.6 [Ca2+]i熒光檢測 取大腦頂葉皮層3 mm×3 mm 剪碎后置于1.5 mL冰Hanks液中，輕輕吹打10 min，過200目濾網(wǎng)。低溫下以1 000 r/min離心5 min，取沉淀用冰Hanks液洗2次，用含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成約106個/mL的單細胞懸液備用。錐蟲藍(臺盼藍)染色鏡下觀察200個細胞，計數(shù)存活細胞數(shù)>95%。取細胞懸液1 mL離心棄上清后加入含100 mL/L小牛血清的Hanks液1 mL，37 ℃預溫5 min后加入7.5 μL 的Fura-2AM (終濃度為6 μmol/ L)；恒溫振蕩孵育45 min后用含100 mL/L小牛血清的Hanks液洗滌2次；另取同一細胞懸液1 mL不負載Fura-2AM作為空白對照。

熒光測定：上述單細胞懸液37 ℃復溫2～3 min后在流式細胞儀上檢測熒光強度。測定時激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為510 nm，分別測定F，F(xiàn)max， Fmin。F為380 nm激發(fā)波長測得的熒光強度值；Fmax為最大熒光強度值，即加入Triton X-100(終濃度為1 mL/L)后所測得的熒光強度值；Fmin為最小熒光強度值，即在Fmax基礎上加入EGTA(終濃度為5 nmol/L)后所測得的熒光強度值。[Ca2+]i濃度計算：[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)(nmol/L)，其中Kd=224 nmol/L，為Fura-2AM與Ca2+的解離常數(shù)[6]。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 各組大鼠于預定時間點灌注取腦，取部分頂葉皮層，用細胞膜蛋白試劑盒提取細胞膜蛋白，以BSA為標準，用BCA法進行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE 電泳，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜放入50 g/L脫脂牛奶中37 ℃封閉2 h后，加入一抗(TRPC1，1∶1 000；NeuN，1∶500；β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后，用增強化學發(fā)光法觀察顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照后采用ImageJ軟件測定條帶吸光度作定量分析。

1.8 TUNEL檢測皮層神經(jīng)元凋亡 DAI模型組、干預模型組及正常組各3只大鼠在預定的時間點深度麻醉后，經(jīng)左心室灌注固定后迅速開顱取腦，40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋后連續(xù)冠狀切片，每個腦塊10張，片厚5 μm。按照TUNEL凋亡試劑盒提供步驟進行TUNEL染色。圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)TUNEL陽性神經(jīng)元[7]。

2 結 果

2.1 皮層神經(jīng)元及軸索的形態(tài)學變化 HE染色可見DAI模型組皮層下組織疏松，神經(jīng)元形態(tài)異常，有空泡、核碎裂、核固縮等形成，在靠近大腦中線附近皮層中可見點狀出血，部分大腦皮層下可見小神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生及微血管生成，而在正常組中皮層下組織結構緊密，神經(jīng)元形態(tài)正常，膠質(zhì)細胞分布均勻(圖1A～D)。NeuN染色可見正常組中神經(jīng)軸突形態(tài)正常，樹突結構連續(xù)，樹突形態(tài)光滑，DAI模型組中可見軸縮球形成，樹突部分形成串珠狀結構(圖1E、F)。透射電鏡下可見DAI模型組中神經(jīng)元腫脹，其內(nèi)線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，嵴紊亂，周圍有高密度電子物質(zhì)生成，細胞核變形，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，染色質(zhì)不均勻、邊集、濃縮；正常組中可見髓鞘形態(tài)完整，結構連續(xù)，其內(nèi)可見神經(jīng)纖維斷層；DAI模型組中可見髓鞘正常結構被破壞，軸突斷裂，髓鞘腫脹，髓鞘連續(xù)性片層結構疏松、分離或消失，片層結構內(nèi)缺乏神經(jīng)纖維和線粒體(圖1G～J)。

2.2 [Ca2+]i變化 DAI模型組中皮層神經(jīng)元[Ca2+]i在1 d時明顯升高，之后逐漸降低，至10 d時降至最低。SKF96365干預模型組中皮層神經(jīng)元[Ca2+]i雖在1 d開始上升，總體升高趨勢被明顯抑制，高于正常組，與DAI模型組相比較有統(tǒng)計學意義(圖2，P<0.05)。

2.3 TRPC1在皮層中表達變化 免疫組化染色顯示，DAI后TRPC1可在大腦皮層中廣泛表達，并主要在大腦板層Ⅱ至V中表達；其中DAI后1 d表達顯著，之后表達逐漸降低，10 d時表達已較弱(圖3A～E)。SKF96365干預模型組中TRPC1在1 d時表達可被抑制，其表達趨勢未出現(xiàn)顯著增加(圖3F～J)。Western blot結果顯示，DAI模型組皮層中TRPC1蛋白的表達在1 d時最高，之后呈逐漸下降趨勢，至10 d達到最低，灰度值分析顯示DAI模型組1 d及3 d與其他各組相比有統(tǒng)計學意義(圖4A，P<0.05)；NeuN在DAI后表達明顯降低，在1 d時最顯著，與其他時間段相比有統(tǒng)計學意義，之后逐漸升高(圖4A，P<0.05)。SKF96365干預模型組中TRPC1蛋白的表達明顯被抑制，灰度分析顯示各個時間段之間相比無統(tǒng)計學意義(圖4B，P>0.05)；NeuN在干預模型組中表達呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，在5 d 時達到峰值，之后逐漸降低(圖4B)。

圖1 皮層神經(jīng)元及軸索形態(tài)學的變化Fig.1Morphologicalchangesofcorticalneuronsandaxon

A：正常大鼠皮層結構(HE, ×200)；B：DAI模型組1 d的皮層結構，見皮層下有出血點；C：DAI模型組3 d皮層結構疏松；D：DAI模型組5 d組皮層下有血管生成；E：正常組NeuN染色，神經(jīng)元軸突及樹突結構正常(×100)；F：DAI模型組NeuN染色，神經(jīng)元軸突存在，樹突不連續(xù)，有軸縮球形成(×100)；G：DAI模型組神經(jīng)元內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體擴張，可見高密度電子物質(zhì)(×10 000)；H：DAI模型組中腫脹的神經(jīng)元及周圍空泡形成(×10 000)；I：DAI模型組中髓鞘變性，正常結構破壞，神經(jīng)纖維消失(×10 000)；J：SKF96365干預組中髓鞘結構部分保留，其內(nèi)神經(jīng)微絲存在(×4 000)。

圖2 DAI模型組及SKF96365干預組[Ca2+]i變化

Fig.2 Changes of intracellular calcium concentration in DAI group and SKF96365 intervention DAI group

2.4 TUNEL陽性神經(jīng)元表達及計數(shù) TUNEL染色結果顯示，DAI模型組在1 d時已有皮層神經(jīng)元的TUNEL陽性細胞，之后逐漸增多，至5 d時最多；SKF96365干預模型組中TUNEL陽性細胞雖較正常組有增高，但其顯著增高趨勢被抑制。TUNEL陽性細胞計數(shù)表明，DAI模型組中3、5、7 d與SKF96365干預模型組對比有統(tǒng)計學意義(圖5、圖6，P<0.05)。

2.5 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 DAI模型組動物在建模后均出現(xiàn)精神淡漠、嗜睡、活動減少、飲水和進食減少，體質(zhì)量較術前明顯減輕。而SKF96365干預模型組以上大體表現(xiàn)在1 d后出現(xiàn)明顯改善。DAI模型組各個時間段神經(jīng)功能評分與SKF96365干預模型組各個時間段神經(jīng)功能評分相比差異有統(tǒng)計學意義(表1，P<0.05)。

表1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分結果

Tab.1 The neurological severity scores of rats in different groups (±s)

與正常對照組比較，*P<0.05，與DAI模型組比較，△P<0.05。

圖3 DAI模型組及SKF96365干預模型組TRPC1在大腦皮層的免疫組化染色Fig.3ImmunohistochemicalstainingofTRPC1inthecere-bralcortexofDAIgroupandSKF96365interventiongroup

DAI模型組：A：1 d組皮層TRPC1免疫組化染色，此時表達最明顯；B：3 d組皮層TRPC1免疫組化染色，表達較前下降；C：5 d組皮層TRPC1免疫組化染色，表達進一步下降；D：7 d組皮層TRPC1免疫組化染色，表達明顯下降；E：10 d組皮層TRPC1免疫組化染色，表達接近正常。SKF96365干預模型組：F：1 d組皮層TRPC1免疫組化染色；G：3 d組皮層TRPC1免疫組化染色；H：5 d組皮層TRPC1免疫組化染色；I：7 d組皮層TRPC1免疫組化染色；J：10 d組皮層TRPC1免疫組化染色。F～J各組表達未出現(xiàn)明顯改變。

圖4 DAI模型組及SKF96365干預模型組皮層TRPC1及NeuN蛋白表達及灰度值分析

Fig.4 The protein expressions and gray value analysis of TRPC1 and NeuN in DAI group and SKF96365 intervention group

A：DAI模型組1、3 d時TRPC1蛋白表達明顯升高，與其他各組相比有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)；NeuN表達在1 d時減少，之后逐漸升高。B：DAI干預模型組[Ca2+]iTRPC1蛋白表達升高不顯著；NeuN表達在3 d時升高，5 d達峰值，之后有所下降。

圖5 DAI模型組及SKF96365干預模型組皮層TUNEL染色Fig.5TUNELstainingofTUNEL-positivecellsinDAIgroupandSKF96365interventiongroup

DAI模型組：A：1 d組皮層TUNEL染色；B：3 d組皮層TUNEL染色，TUNEL陽性細胞表達增多；C：5 d組皮層TUNEL染色，TUNEL陽性細胞表達最多；D：7 d組皮層TUNEL染色，TUNEL陽性細胞表達開始減少；E：10 d組皮層TUNEL染色，TUNEL陽性細胞顯著減少。SKF96365干預模型組：F：1 d組皮層TUNEL染色；G：3 d組皮層TUNEL染色；H：5d組皮層TUNEL染色；I：7 d組皮層TUNEL染色；J：10 d組皮層TUNEL染色。F～J：TUNEL陽性細胞表達被顯著抑制。

圖6 DAI模型組及SKF96365干預模型組皮層TUNEL陽性細胞計數(shù)

Fig.6 Cell count of TUNEL-positive cells in DAI group and SKF96365 intervention group

與同時間點SKF96365組相比，*P<0.05。

3 討 論

TBI后病理生理機制的研究有賴于可靠的動物及細胞模型的建立。目前，有關TBI動物模型建立的方法主要包括有液壓沖擊模型、控制性皮層損傷模型、自由落體模型及瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型等[8]，而目前僅有瞬間旋轉(zhuǎn)動物模型可較好的模擬DAI后病理生理改變。本研究團隊既往利用自制瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型較好模擬了DAI后病理生理改變[4,9-10]。在瞬間旋轉(zhuǎn)損傷后，經(jīng)HE染色、組織化學染色及電鏡檢測可發(fā)現(xiàn)，DAI后位于大腦中線的皮層下組織結構疏松性改變，可伴有點狀出血，有軸縮球形成，樹突部分形成串珠狀結構，神經(jīng)元腫脹，細胞器擴張，胞核變形，胞質(zhì)空泡形成，髓鞘結構被破壞，軸突斷裂，片層結構內(nèi)神經(jīng)纖維缺乏。這些改變符合DAI后皮層的病理改變，說明本實驗所采用的瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型是可靠的。在DAI發(fā)生時，大腦白質(zhì)內(nèi)所有的軸突均經(jīng)歷了類似的動態(tài)損傷過程。在某些特定區(qū)域，如大腦中線附近的軸突出現(xiàn)水腫，造成離子轉(zhuǎn)運體異常聚集，導致正常離子轉(zhuǎn)運障礙；即使其周圍正常軸突并未出現(xiàn)離子轉(zhuǎn)運障礙，這些軸突仍可發(fā)生病理生理學改變，導致軸突功能障礙，如在輕度創(chuàng)傷性腦損傷(mild traumatic brain injury, mTBI)后可觀察到神經(jīng)傳導速度的改變[11]。

TRPC1是哺乳動物TRP家中第一個被認為可形成離子通道的成員[12]。在初期研究中，TRPC1的表達可使由Ca2+庫耗竭激活的非選擇性陽離子電流升高。由于其廣泛表達，TRPC1的功能與其他TRPC亞基可在體外[13]和體內(nèi)[14]共同作用。本研究選擇TRPC1作為目標蛋白，研究其在DAI后的作用及可能的機制。SKF96365可抑制TRPC離子通道的活性，減少鈣內(nèi)流，是TRPC離子通道常用阻斷劑之一[15]，本研究通過立體定向側(cè)腦室顯微注射將SKF96365注入腦脊液循環(huán)中。本實驗結果表明，DAI后TRPC1的表達增高，在1d時最為明顯，此后逐漸下降，而針對皮層神經(jīng)元[Ca2+]i的檢測發(fā)現(xiàn)，DAI后[Ca2+]i的變化趨勢與TRPC1變化趨勢相一致，在建模后1d時[Ca2+]i最高，之后逐漸降低。應用TRPC1通道阻斷劑干擾其活性后，TRPC1表達增高趨勢被明顯抑制，而[Ca2+]i的升高也被抑制，說明TRPC1與神經(jīng)元胞內(nèi)鈣內(nèi)流趨勢呈正相關。前期研究已證實[2]，在胞外Ca2+缺失的情況下，大鼠視神經(jīng)及脊髓后索神經(jīng)中軸質(zhì)Ca2+水平的增加是為了應對體外有髓鞘軸突的缺血，這表明胞內(nèi)鈣庫在軸突變性中起重要作用。胞外Ca2+通過軸膜內(nèi)流，在缺血性脊髓后索軸突中，軸突內(nèi)鈣超載通過蘭尼堿受體介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣內(nèi)流而發(fā)生，還可通過應對磷脂酶C(PLC)介導IP3生成的1,4,5,-磷酸腺苷受體來釋放，或可通過線粒體中的Ca2+釋放。軸索損傷后的離子失衡被認為在軸索損傷后軸突變性和其他未受損軸突的持續(xù)功能障礙中起關鍵作用。近來有研究利用軸突牽張損傷模型發(fā)現(xiàn)，[Ca2+]i的急性升高可能部分來自于胞內(nèi)鈣庫的釋放[16]。

研究表明，脫髓鞘在TBI的病理生理過程中亦發(fā)揮重要作用。本研究中，利用電鏡觀察到DAI后正常髓鞘結構發(fā)生明顯改變，軸突斷裂，髓鞘腫脹，髓鞘連續(xù)性片層結構疏松、分離或消失，片層結構內(nèi)缺乏神經(jīng)纖維和線粒體。而抑制TRPC1介導的鈣內(nèi)流后，DAI后髓鞘正常結構可得到部分保存，大鼠神經(jīng)功能缺損評分亦得到明顯改善。有研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠視神經(jīng)的牽張性損傷后可發(fā)生髓鞘的急性斷裂。但是，尚不清楚髓鞘損傷的發(fā)生是否僅為軸突變性的直接結果。臨床上可在急性或慢性TBI后觀察到凋亡性少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞，而少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞的丟失可能造成髓鞘形成不足，潛在的影響軸突完整性及其功能[17]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+感受器STIM1可在DAI后早期腦損傷中發(fā)揮重要作用[9]，而TRPC1通道被認為亦可發(fā)揮類似于鈣庫操控性鈣通道(store-operated calcium channels, SOCs)的功能，作為SOCC通道的篩選亞型而引起關注，研究主要集中在TRPC通道的受體激活和庫依賴性鈣內(nèi)流方面[18]。近期研究表明，STIM1調(diào)控TRPC通道的開放，TRPCs與Orais可共同作用。雖然許多研究支持TRPCs可發(fā)揮SOCs的作用，但其作用似乎僅存在于部分細胞系或特定條件下。初期研究表明，STIM1與多種TRPC通道結合，并門控TRPCs[19]。隨后許多研究證實了STIM1和TRPC1之間的相互作用[20]。然而，近期有學者發(fā)現(xiàn)未有證據(jù)證明TRPC1鈣庫依賴調(diào)控的，但報道了其在Ca2+游離溶液中可被DAG激活。研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下當細胞被激活PLC-β的激動劑所刺激時，TRPC1的表達并不造成可檢測到的離子電流[14]。TRPC1可能是不同異源性TRP復合物的一個組分，其是否可在其他TRP亞基不存在的情況下形成功能性通道目前尚未有研究。

綜上所述，DAI后早期皮層高表達的TRPC1通道蛋白，是造成髓鞘變性及神經(jīng)元鈣內(nèi)流的重要原因，過度鈣信號的傳入可觸發(fā)下游細胞凋亡機制，引起腦損傷；抑制TRPC1的表達可減少神經(jīng)元凋亡，抑制髓鞘變性，改善神經(jīng)功能。而TRPC1與STIM1是否在DAI后共同發(fā)揮SOCC作用，尚需進一步研究證實。

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(編輯 韓維棟)

The mechanism of high expression of TRPC1 in diffuse axnoal injury of rats

ZHANG Ming1,2, SONG Jin-ning2, LI Yu2, ZHAO Yong-lin2,LI Dan-dong2, WU Yuan3, FU Zhou-feng2, ZHANG Bin-fei2

(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Department of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061;3. Department of Critical Care Medicine, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To investigate the possible role of canonical transient receptor potential channel 1 (TRPC1) after diffuse axonal injury (DAI) and discuss the mechanism of TRPC1 involved in calcium overload of neurons and myelin degeneration after DAI. Methods Rat models of DAI were established with the method of rotational acceleration of the brain. DAI intervention group was established by using SKF96365 intracerebroventricular injection. Intracellular calcium concentration was detected by Fura-2AM. The dynamic expressions of TRPC1 in the cortex were determined by Western blot and immunohistochemical staining. The results were compared with those in DMSO control group and normal group. The changes of neurons and myelin sheath were detected under electron microscope. The apoptosis of cortical neurons was detected by TUNEL. One-way ANOVA was used to compare within each group. Results The protein expressions of TRPC1 in the cortex increased after DAI and reached the peak at day 1 and then gradually decreased while intracellular calcium concentration also reached the peak at day 1. The structure of myelin sheath was destructed at the same time. After injection of TRPC1 blocker SKF96365, the protein expression of TRPC1 was inhibited and intracellular calcium concentration decreased. Meanwhile, the structure of myelin sheath was partially reserved and the scores of neurological functions in rats were improved. Conclusion TRPC1-induced calcium overload after DAI is the major cause of myelin degeneration and neuronal death. Suppressing the calcium influx induced by TRPC1 can protect the normal structure of myelin and improve neuronal apoptosis.

transient receptor potential channel 1 (TRPC1); diffuse axonal injury(DAI); myelin degeneration; calcium overload; neuronal apoptosis

2014-04-21

2014-06-26

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774),the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師. E-mail: jinnings@126.com

張明(1981-)，男(漢族)，博士，主治醫(yī)師. 研究方向：腦血管病、顱腦損傷的基礎與臨床. E-mail: phoenixzhang@126.com

時間：2014-09-19 16∶34 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.1634.005.html

R651.1

A

10.7652/jdyxb201406004