羊建平　武彩紅　趙旭庭　周春寶　姚靜　張斌　鄭筱峰

摘要：采集姜曲海豬精液，對(duì)其進(jìn)行超低溫冷凍保存，解凍后分別通過(guò)顯微鏡、掃描電鏡和吖啶橙染色觀察其形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和DNA完整性，探討冷凍保存對(duì)豬精子DNA完整性及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)探討海藻糖和乳糖對(duì)冷凍精子的保護(hù)作用。結(jié)果表明，冷凍后精子形態(tài)正常率（海藻糖組和乳糖組分別為74.7%、67.6%）及DNA完整率（海藻糖組和乳糖組分別為66.4%和63.2%）均顯著低于新鮮精子（95.5%和94.7%），且冷凍組間也存在顯著差異（P<0.05）；冷凍造成精子結(jié)構(gòu)不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為精子頭頸部發(fā)生部分或全部斷裂，頸部腫脹，頂體結(jié)構(gòu)損傷。

關(guān)鍵詞：豬精子；冷凍保存；DNA；形態(tài)結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.3+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0151-02

收稿日期：2013-05-20

項(xiàng)目基金：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK2008589）；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目[編號(hào)：蘇教師2010（27）號(hào)]；江蘇省無(wú)錫市農(nóng)業(yè)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：羊建平（1965—），男，江蘇泰興人，碩士，副教授，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)教學(xué)及科研工作。E-mail：jstzyip@yahoo.com.cn。精子的長(zhǎng)期保存在畜牧業(yè)、低溫生物學(xué)種質(zhì)資源保存及動(dòng)物基因研究等方面具有重要的意義；但冷凍保存豬精液應(yīng)用于人工授精的比例尚不足1%，仍存在冷凍-解凍后活力差、受胎率低、產(chǎn)仔數(shù)少等諸多問(wèn)題[1-2]。許多學(xué)者致力于豬冷凍精液的研究，但關(guān)于精子冷凍后DNA損傷及超微結(jié)構(gòu)研究較為缺乏。因此，本試驗(yàn)探索冷凍保存對(duì)豬精子DNA完整性及超微結(jié)構(gòu)的影響。

1材料與方法

1.1精液采集

4只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海種公豬由國(guó)家級(jí)姜曲海種豬場(chǎng)提供。利用手握法采集精液，立即置于保溫桶中，1 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將精液用專(zhuān)用濾紙過(guò)濾至37 ℃預(yù)熱燒杯中，然后按照1 ∶1.5與稀釋液（德國(guó)米尼圖MII稀釋劑）進(jìn)行稀釋。

1.2稀釋液和冷凍液的配置

1.2.1冷凍基礎(chǔ)液的配置分別稱(chēng)取葡萄糖1.1 g，Tris 2.42 g，檸檬酸鈉1.48 g，青霉素0.06 g和鏈霉素0.1 g，溶解于雙蒸水中，定容至100 mL。

1.2.2冷凍液的配置冷凍I液：海藻糖組（冷凍1組），在稀釋液的基礎(chǔ)上添加375 mmol/L 海藻糖、0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.05 %維生素C和20%卵黃；乳糖組（冷凍2組），在稀釋液的基礎(chǔ)上添加375 mmol/L 乳糖、0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.05 %維生素C和20%卵黃。冷凍Ⅱ液：在冷凍I液的基礎(chǔ)上添加甘油，使其終濃度為3%。

1.2.3吖啶橙染色液的配置吖啶橙溶液：吖啶橙0.1 g溶解于100 mL蒸餾水中；枸櫞酸溶液：枸櫞酸1.91 g溶解于100 mL蒸餾水中；磷酸氫二鈉溶液：Na2HPO4·12H2O 10.74 g于100 mL蒸餾水中。臨用時(shí)，分別取吖啶橙染色液10 mL、枸櫞酸溶液40 mL、磷酸氫二鈉溶液7.5 mL混合，即為吖啶橙染色液。

1.3精液冷凍-解凍方法

將1 ∶1.5稀釋后的精液置于17 ℃過(guò)夜，17 ℃離心（800 g，12 min），棄上清，然后加入冷凍I液于4 ℃平衡 1.5 h；再加入等體積4 ℃預(yù)冷的冷凍Ⅱ液，使精液最終稀釋比為 1 ∶2，然后再于4 ℃平衡、分裝于0.25 mL細(xì)管中，不超過(guò) 45 min，距液氮面3 cm熏蒸10 min，然后投入液氮保存 7 d。

解凍時(shí)，將細(xì)管從液氮中迅速取出，直接投入37 ℃水浴中并迅速搖晃。將解凍后的精液收集于10 mL試管內(nèi)，然后用9倍體積的PBS液清洗精子。

1.4精子正常形態(tài)率的檢測(cè)

于相差顯微鏡下直接觀察活精子的正常形態(tài)率，至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子。將巨型精子，短小精子，雙頭或雙尾精子，頂體膨脹或脫落精子，精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部變曲精子等，均視為畸形精子。

1.5精子DNA完整性的檢測(cè)

將精液用PBS洗3次，棄上清，調(diào)整精子濃度為2×104個(gè)/mL，涂片，自然晾干，無(wú)水乙醇-冰醋酸（3 ∶1）固定 5 min，然后置入盛有新鮮配制的吖啶橙染液的染色缸中染色10 min。蒸餾水清洗，晾干后，石蠟油封片，于熒光顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)[3]。DNA 雙鏈完整的精子呈現(xiàn)綠色，表明有受精能力；DNA 雙鏈損傷的精子呈現(xiàn)紅色或黃色，表明無(wú)受精能力，計(jì)數(shù)300個(gè)精子。

1.6掃描電鏡樣本制備

新鮮和試驗(yàn)1組冷凍-解凍精子樣本于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，再經(jīng)PBS清洗3次，1次30 min；隨后，將精子包埋于4%瓊脂中，再于1%鋨酸（OsO4）中固定1.5 h，然后再經(jīng)PBS清洗3次[4]；之后，乙醇逐級(jí)脫水，乙酸異戊脂置換；臨界點(diǎn)干燥儀干燥，IB-5離子濺射儀噴金，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察、拍照。

1.7數(shù)據(jù)處理

所獲試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果

2. 1冷凍對(duì)豬精子超微結(jié)構(gòu)的影響

在掃描電鏡下，豬新鮮精子（圖1-A、B）頭、頸、尾結(jié)構(gòu)完整；頭部由細(xì)胞核和頂體組成；頂體結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，邊緣整齊，局部無(wú)隆起，表面無(wú)空洞；尾部完整。冷凍-解凍后，豬精子頭部和頸部發(fā)生全部或部分?jǐn)嗔眩▓D1-C、D、E），頸部腫脹（圖1-E）；頂體結(jié)構(gòu)損傷（圖1-E）或消失僅見(jiàn)核結(jié)構(gòu)（圖1-F）。

2.2冷凍對(duì)豬精子形態(tài)正常率及DNA完整性的影響

由表1可見(jiàn)，冷凍1組、冷凍2組及新鮮對(duì)照組間精子形態(tài)正常率和DNA完整率均存在顯著差異（P<0.05），且冷凍1組和冷凍2組精子的形態(tài)正常率和DNA完整率又顯著低于新鮮精子（P<0.05）。冷凍1組的形態(tài)正常率及DNA完整率又顯著高于冷凍2組（P<0.05）。

表1冷凍對(duì)豬精子形態(tài)正常率及DNA完整性的影響

處理1形態(tài)正常率

（%）1DNA完整率

（%）海藻糖組（冷凍1組）174.7±1.75b166.4±1.68b乳糖組（冷凍2組）167.6±1.52c163.2±1.84c新鮮精液（對(duì)照組）195.5±1.55a194.7±1.70a注：同一列后不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。

3討論

精子的受精能力與精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[5]。頂體位于精子頭部前端，其內(nèi)含有多種與受精相關(guān)的酶。精卵融合前精子必須發(fā)生頂體反應(yīng)，頂體酶才能發(fā)揮作用[6]?？梢?jiàn)，完整的頂體結(jié)構(gòu)是正常頂體反應(yīng)的基礎(chǔ)。精子細(xì)胞作為遺傳物質(zhì)的主要傳遞者，其DNA完整程度直接關(guān)系到精子質(zhì)量及其后代的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，冷凍后豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)及DNA完整率均顯著低于新鮮精子。在掃描電鏡下，冷凍精子頭頸結(jié)合處斷裂、頸部腫脹、頂體結(jié)構(gòu)損傷或消失。許多研究結(jié)果表明，冷凍損傷是低溫冷凍任何哺乳動(dòng)物精子所難以避免的。冷凍損傷主要與細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成所致的機(jī)械性損傷及滲透壓改變所致的化學(xué)性損傷[8-9]、細(xì)胞膜功能紊亂[10]和Na+-K+-ATP酶障礙[11]等因素有關(guān)。

本研究也發(fā)現(xiàn)，添加海藻糖組的冷凍精子形態(tài)完整率和DNA完整性均比添加乳糖組的高，表明海藻糖對(duì)豬精子冷凍保存具有較好的保護(hù)作用，這與張樹(shù)山等的研究結(jié)果[12]一致。海藻糖是一種非常穩(wěn)定的非還原性雙糖，在冷凍過(guò)程中，可以在細(xì)胞膜外產(chǎn)生一種玻璃狀的防護(hù)層，從而提高細(xì)胞對(duì)高滲透的耐受性，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性[13]。冷凍過(guò)程中，精子核蛋白對(duì)DNA雙鏈的保護(hù)作用被削弱，造成精子線粒體與核基因組的DNA損傷，DNA雙鏈變性為單鏈DNA，該損傷可能是造成胚胎發(fā)育不良和流產(chǎn)的主要原因。李剛琴等的研究結(jié)果表明，精子DNA易受活性氧的攻擊，造成氧化損傷，進(jìn)而引起形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而發(fā)生不育[7]。但有資料表明，人精子冷凍保存并不影響完整的精子核DNA鏈，僅可能加重冷凍前已損傷精子核DNA鏈的損傷程度[14-15]，這可能和人精子冷凍保存方法成熟有關(guān)，但也說(shuō)明豬精子冷凍保存方法仍需繼續(xù)探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]張樹(shù)山，李青旺，胡建宏，等. 紅景天多糖對(duì)豬精子冷凍保護(hù)效果的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18（3）：519-525.

[2]Flores E，Cifuentes D，F(xiàn)ernández-Novell J M，et al. Freeze-thawing induces alterations in the protamine-1/DNA overall structure in boar sperm[J]. Theriogenology，2008，69（9）：1083-1094.

[3]孫靜波，姜宏，何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)男科學(xué)雜志，2010，24（4）：26-29.

[4]彭影，劉雨生，童先宏，等. 掃描電鏡下畸形精子增多癥患者的精子形態(tài)觀察[J]. 中國(guó)男科學(xué)雜志，2007，21（2）：37-42，45.

[5]Pesch S，Bergmann M. Structure of mammalian spermatozoa in respect to viability，fertility and cryopreservation[J]. Micron，2006，37（7）：597-612.

[6]OFlaherty C，Rodriguez P，Srivastava S. L-arginine promotes capacitation and acrosome reaction in cryopreserved bovine spermatozoa[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2004，1674（2）：215-221.

[7]李剛琴，何映. 精子線粒體DNA損傷與男性不育[J]. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（4）：4-5.

[8]Agca Y，Mullen S，Liu J，et al. Osmotic tolerance and membrane permeability characteristics of rhesus monkey（Macaca mulatta）spermatozoa[J]. Cryobiology，2005，51（1）：1-14.

[9]Agca Y，Critser J K. Cryopreservation of spermatozoa in assisted reproduction[J]. Seminars in Reproductive Medicine，2002，20（1）：15-23.

[10]Pegg D E. The history and principles of cryopreservation[J]. Seminars in Reproductive Medicine，2002，20（1）：5-13.

[11]Martin G，Sabido O，Durand P，et al. Cryopreservation induces an apoptosis-like mechanism in bull sperm[J]. Biology of Reproduction，2004，71（1）：28-37.

[12]張樹(shù)山，李青旺，李剛，等. 海藻糖、蔗糖和乳糖對(duì)豬精液冷凍保護(hù)效果的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，34（6）：41-45，51.

[13]García de Castro A，Tunnacliffe A. Intracellular trehalose improves osmotolerance but not desiccation tolerance in mammalian cells[J]. FEBS Letters，2000，487（2）：199-202.

[14]宋博，鄭履康，鄧麗霞，等. 冰凍對(duì)精子DNA的影響[J]. 中華男科學(xué)，2002，8（4）：253-254.

[15]肖清明，徐紅，何宗明，等. 精液冷凍對(duì)不育患者精子核DNA鏈完整性影響的研究[J]. 山東醫(yī)藥，2005，45（19）：10-11.邵春榮，黃廣明，李健. 微生態(tài)制劑克洛生對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：153-154.