張 鋒，孫 鑫，李 舒，王坤坤，姜海宇，劉露陽(yáng)，吳長(zhǎng)君，汪 勇

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150001；3.意大利百勝公司，哈爾濱 150001)

研究報(bào)告

兔股動(dòng)脈狹窄的超聲與病理對(duì)照研究

張 鋒1，孫 鑫2，李 舒1，王坤坤1，姜海宇1，劉露陽(yáng)1，吳長(zhǎng)君1，汪 勇3

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150001；3.意大利百勝公司，哈爾濱 150001)

目的 探討高頻超聲在兔股動(dòng)脈狹窄的應(yīng)用價(jià)值。方法 24只新西蘭兔隨機(jī)分為三組，每組8只，制備兔股動(dòng)脈硬化模型：股動(dòng)脈球囊損傷后分別高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周，取耳緣靜脈血檢測(cè)膽固醇水平的變化，采用18 MHz超高頻超聲探頭觀察股動(dòng)脈的狹窄情況，測(cè)量造模處直徑狹窄率、收縮期峰值血流速度(PSV)，病理檢測(cè)動(dòng)脈管腔的面積狹窄率。結(jié)果 (1)隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，血中膽固醇水平遞增，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(2)與造模前(0周)相比較，高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周時(shí)股動(dòng)脈造模處出現(xiàn)不同程度的狹窄，狹窄程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；狹窄處收縮期血流峰值流速隨著狹窄程度的增加而加快，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(3)隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，病理組織的面積狹窄率增加，組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 (1)高脂喂養(yǎng)加球囊損傷能造成不同程度的兔股動(dòng)脈狹窄；(2)超高頻超聲能夠清晰地顯示不同程度的兔股動(dòng)脈狹窄，可用于動(dòng)物外周血管疾病模型的檢測(cè)。

超高頻超聲；直徑狹窄率，收縮期峰值流速(PSV)；動(dòng)脈狹窄，面積狹窄率；兔

冠心病、糖尿病是常見(jiàn)病、多發(fā)病，在我國(guó)發(fā)病率逐年上升，并且常累及動(dòng)脈系統(tǒng)，引起外周血管疾病，隨著病變的進(jìn)展，病人出現(xiàn)間歇性跛行、靜息痛等癥狀。下肢血管病變是糖尿病病人致死致殘的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者的下肢截肢率是非糖尿病患者的15倍，50%的截肢患者在四年內(nèi)進(jìn)行對(duì)側(cè)截肢。因此，早期發(fā)現(xiàn)、診斷病變，阻止病情進(jìn)一步發(fā)展，將有助于疾病的預(yù)后。為了達(dá)到這一目的，很多學(xué)者已經(jīng)利用動(dòng)物模型在動(dòng)脈硬化的形成機(jī)制方面做了大量的研究，但目前的文獻(xiàn)顯示動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型的檢測(cè)手段大部分仍然僅局限于組織的病理學(xué)診斷，這一現(xiàn)狀一定程度上限制了科學(xué)研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)展。本研究擬采用18 MHz超高頻超聲探頭評(píng)估兔股動(dòng)脈的狹窄，探討超高頻超聲在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血管疾病中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇24只雄性新西蘭兔，體質(zhì)量(2.5～3.0)kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)SYXK(黑)2013-002)。

1.2 動(dòng)物分組及模型的制備

24只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為三組，每組8只，均進(jìn)行雙側(cè)股動(dòng)脈球囊損傷。使用戊巴比妥鈉(30 mg/mL)耳緣靜脈注射麻醉，劑量為30 mg/kg，麻醉后將動(dòng)物固定于兔臺(tái)上。電推去術(shù)區(qū)毛發(fā)，手觸及股動(dòng)脈搏動(dòng)后，局部消毒、開(kāi)皮、分離股動(dòng)脈，找到股動(dòng)脈主干和其分叉腘動(dòng)脈及隱動(dòng)脈，耳緣靜脈注入肝素，動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈近心端，手術(shù)縫線結(jié)扎腘動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，眼科剪剪開(kāi)腘動(dòng)脈近心端(距離股動(dòng)脈分叉點(diǎn)2 cm)，插入球囊(2.0 × 15) mm距離股動(dòng)脈分叉約1.5 cm處，6～8 atm打入球囊中，來(lái)回拉動(dòng)球囊三次損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，撤去球囊壓力，拔出球囊，結(jié)扎腘動(dòng)脈近心端，逐層縫合肌肉及皮膚。術(shù)后肌注青霉素5 d(40萬(wàn)單位/d)，三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后分別高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周。高脂飼料成分為：1.5%膽固醇，10%豬油，7.5%蛋黃粉。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

Mylab90彩色多普勒超聲診斷儀(百勝公司)，LA435線陣探頭，探頭中心頻率18 MHz(百勝公司)，光學(xué)顯微鏡(Nikon 公司)，切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)，戊巴比妥鈉(Sigma 公司)，多聚甲醛( Sigma公司)，肝素鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)，青霉素(山西振東泰盛制藥有限公司)，HE染色液(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.4 超聲掃查內(nèi)容

分別于造模前(即0周)、4周、8周、12周進(jìn)行超聲檢查，掃查深度及增益條件均保持一致。觀察雙側(cè)股動(dòng)脈長(zhǎng)軸方向距離股動(dòng)脈分叉前1.5 cm處有無(wú)斑塊形成，及管腔狹窄處的直徑狹窄率(D%)，彩色多普勒超聲觀察動(dòng)脈管腔內(nèi)的血流充盈情況，測(cè)定狹窄處的收縮期峰值血流速度(PSV)。

1.5 血膽固醇水平的測(cè)定

分別檢測(cè)0周、4周、8周、12周靜脈血中總膽固醇的水平。

1.6 病理檢測(cè)

三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于4周、8周、12周行病理取材，取材部位為股動(dòng)脈分叉前(1～2)cm，4% 甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察動(dòng)脈管腔的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，并測(cè)量動(dòng)脈管腔的面積狹窄率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組兔血中膽固醇水平結(jié)果分析

4周、8周、12周兔血膽固醇水平別為(535.98±136.36)mg/dL、(1144.32±156.01)mg/dL、(1943.46±182.27)mg/dL，與0周的(63.61±34.08)mg/dL比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；三組之間血中總膽固醇水平兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)，即隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，血中膽固醇水平遞增。

圖1 各組間血膽固醇水平比較(*** P<0.001)Fig.1 Comparison of blood cholesterol levels at different time points

2.2 超聲檢查結(jié)果分析

A：0周、4周、8周、12周時(shí)動(dòng)脈管腔的血流充盈情況； B：0周、4周、8周、12周時(shí)動(dòng)脈管腔狹窄處收縮期峰值 流速(PSV)；C：4周、8周、12周時(shí)動(dòng)脈管腔的直徑 狹窄率(#無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、** P<0.01，***P<0.001)圖2 各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈管腔的直徑狹窄率 及收縮期峰值血流速度 A：Blood filling condition at the time of 0 w, 4 w, 8 w and 12 w. B：The peak systolic velocity (PSV) at the stenosis site of the artery lumen at 0 w, 4 w, 8 w and 12 w.C：The diameter stenosis rate of arterial lumen at 4 w, 8 w, and 12 w.Fig.2 The diameter stenosis rate and peak systolic velocity at different time points

與0周時(shí)相比較，4周、8周、12周時(shí)股動(dòng)脈造模處出現(xiàn)不同程度的狹窄，超聲直徑狹窄率分別為(42.25±8.50)%、(59.37±4.53)%、(77.37±5.70)%，8周與4周相比、12周與8周相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)脈狹窄程度逐漸增加；狹窄處收縮期血流峰值流速分別為(25.1±4.86)cm/s，(34.68±6.18)cm/s，(45.98±6.47)cm/s，8周與4周、12周與8周組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，4周與0周時(shí)相比，血流速度呈上升趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。2.3 病理組織學(xué)面積狹窄率及組間比較

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周后，造模處的動(dòng)脈管腔內(nèi)均出現(xiàn)狹窄，病理組織學(xué)的面積狹窄率分別為(50.78±7.28)%、(67.77±6.81)%、(83.20±7.95)%，8周與4周、12周與8周之間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P分別小于0.001、0.01)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)脈管腔橫斷面的殘余面積逐漸減少。(圖3)

注：A：0周、4周、8周、12周時(shí)的動(dòng)脈管腔狹窄情況； B： 4周、8周、12周時(shí)組織面積狹窄率組間比較；圖3 動(dòng)脈管腔組織學(xué)的面積狹窄率 A：The artery lumen stenosis at 0 w, 4 w, 8 w and 12 w. B：Comparison of tissue areal stenosis at 4 w, 8 w and 12 w.Fig.3 Histological areal stenosis of the arterial lumen

2.4 病理與超聲結(jié)果對(duì)照分析

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周的超聲直徑狹窄率與病理組織的面積狹窄率相關(guān)性分析結(jié)果表明， R2=0.60，P<0.001，二者呈線性正相關(guān)(圖4)。

圖4 組織面積狹窄率與超聲直徑狹窄率相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of the tissue area stenosis rate and ultrasonic diameter stenosis rate

3 討論

外周血管疾病是指冠狀動(dòng)脈以外的動(dòng)脈狹窄或閉塞性病變，主要在心血管疾病、糖尿病的人群中發(fā)病率比較高，以動(dòng)脈粥樣硬化性外周動(dòng)脈疾病和糖尿病足為主要表現(xiàn)。此類患者發(fā)病早期可以無(wú)明顯臨床癥狀，隨著病程的進(jìn)展，病情逐漸加重，極大地降低了患者的生活質(zhì)量，增加了致殘率和致死率，給社會(huì)和家庭都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，同時(shí)，外周血管疾病是全身系統(tǒng)性疾病，經(jīng)常與其他血管病變?nèi)珙i動(dòng)脈粥樣硬化同時(shí)存在，而后者則是腦缺血疾病危險(xiǎn)增高的標(biāo)志，對(duì)腦梗死有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[1，2]。研究表明，股動(dòng)脈的硬化比頸動(dòng)脈硬化發(fā)生的更早[3]，Lekakis等[4]研究發(fā)現(xiàn)股總動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度是冠狀動(dòng)脈疾病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，且與冠狀動(dòng)脈硬化呈正相關(guān)。因此，建立可靠的動(dòng)物模型并選擇實(shí)時(shí)、有效、可重復(fù)性好的檢測(cè)手段，對(duì)于研究外周血管疾病很有科研價(jià)值。

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)是目前動(dòng)物模型中最常用的一種動(dòng)脈硬化造模方法[5-8]，本研究采用此方法成功構(gòu)建了兔雙側(cè)股動(dòng)脈狹窄的模型，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在球囊損傷加高脂喂養(yǎng)后4周末即出現(xiàn)了血膽固醇水平升高，病理組織學(xué)顯示動(dòng)脈管腔呈50%左右的狹窄;8周末、12周末血中膽固醇水平進(jìn)一步顯著升高，病理組織學(xué)的管腔狹窄率分別達(dá)到了60%、75%，這與文獻(xiàn)中所報(bào)道的8周出現(xiàn)典型的動(dòng)脈硬化的結(jié)果相一致[10]。

現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型的檢測(cè)手段大部分局限于血中脂類成分的檢測(cè)及病理組織學(xué)的診斷[5]，僅有少數(shù)文獻(xiàn)顯示超聲技術(shù)用于動(dòng)脈硬化模型檢測(cè)動(dòng)物脂肪肝水平及頸動(dòng)脈脈內(nèi)-中膜厚度的變化[11-14]。目前，高頻超聲技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于淺表器官疾病的診斷，包括頸動(dòng)脈疾病、皮下軟組織、乳腺、甲狀腺等方面；高頻超聲被認(rèn)為是一種無(wú)創(chuàng)的、可靠的評(píng)價(jià)人頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度的手段，與MRA、動(dòng)脈造影相比，更經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性更好。以往的研究表明[15-19]，5-12 MHz高頻超聲探頭在診斷正常臂部尺神經(jīng)及正中神經(jīng)病變、外周血管疾病、小兒腹部疾病及腮腺腫瘤方面有肯定的診斷價(jià)值；20 MHz超高頻超聲在診斷乳腺病變、陰莖硬結(jié)、眼、甲狀腺等淺表器官病變的診斷已取得顯著效果[20-23]。 Latham等[23]人使用50 MHz的超高頻微型超聲探頭檢測(cè)術(shù)中尺、橈動(dòng)脈穿刺置管過(guò)程，取得滿意的檢測(cè)圖像，尤其是在6歲以下兒童的術(shù)中麻醉中具有明確的引導(dǎo)作用。人和動(dòng)物股動(dòng)脈位置均比較表淺，本研究采用18 MHz超高頻超聲探頭觀察實(shí)驗(yàn)兔股動(dòng)脈狹窄的情況，結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)4周以后，超聲可以探測(cè)到動(dòng)脈管腔出現(xiàn)了大于40%的狹窄，高脂喂養(yǎng)8周后動(dòng)脈管腔的超聲直徑狹窄率在50%以上，與病理組織學(xué)的面積狹窄率保持一致，二者呈高度正相關(guān)(R2=0.60)。在本實(shí)驗(yàn)中8周和12周組分別有1只、3只兔股動(dòng)脈出現(xiàn)完全堵塞，動(dòng)脈管腔內(nèi)充滿低回聲，未探及血流信號(hào)；隨著狹窄程度的增加，4周管腔內(nèi)狹窄處的血流速度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但與造模前相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8周、12周狹窄處的收縮期峰值流速明顯加快，血流頻譜舒張期反向波，失去動(dòng)脈血流的三相波特點(diǎn)，呈典型的動(dòng)脈狹窄性改變。

綜上所述，球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)可以造成不同程度的兔股動(dòng)脈狹窄，且隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)脈的狹窄程度增加；18 MHz超高頻超聲探頭的應(yīng)用可以清晰顯示兔股動(dòng)脈的管壁結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)狹窄及血流充盈的情況，對(duì)顯示動(dòng)物模型中外周動(dòng)脈狹窄具有靈活、直觀、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)尤其是取血受限的小型動(dòng)物研究的順利進(jìn)行提供便利的條件。

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Comparative study of ultrasonography and pathology in rabbit models of femoral artery stenosis

ZHANG Feng1, SUN Xin2, LI Shu1, WANG Kun-kun1, JIANG Hai-yu1, LIU Lu-yang1, WU Chang-jun1, WANG Yong3

(1. The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Department of Ultrasound, Harbin 150001;2. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Haerbin 150001, China;3. Italy yum, Haerbin 150001)

Objective To explore the application value of ultra-high frequency ultrasound in detection of femoral artery stenosis in rabbits. Methods Twenty-four healthy male New Zealand white rabbits (body weight 2.5-3.0 kg) were randomly divided into three groups, 8 rabbits in each group. Preparation of femoral atherosclerosis model: the rabbits were fed with high fat diet for 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after femoral artery balloon injury, respectively. The changes of cholesterol level were observed. We used ultra-high frequency ultrasonic probe to observe the femoral artery, to assess the diameter stenosis rate and peak systolic velocity (SPV) at the symptomatic side, and the histological areal stenosis was evaluated. Results 1. The blood cholesterol levels were increased after fed high cholesterol diet, with a significant difference among the groups (P<0.001); 2. There was a stenosis to a different degree in the modeling artery after fed high cholesterol diet for 4 wks, 8 wks, and 12 wks, and the stenosis degree was increased gradually. At 12 w, the degree of stenosis was higher than that at 4 w and 8 w, respectively, showing statistical significance (P<0.001). At the symptomatic side, the peak systolic flow velocity was increased, and it was higher at 12 w than that at 4w and 8 w, respectively. 3. With the extension of time, the arterial stenosis rate was increased along with the time course (P<0.05). Conclusions 1. High fat diet combined with balloon injury can cause varying degrees of rabbit femoral artery stenosis; 2. Ultrahigh frequency ultrasound can clearly show different degrees of rabbit femoral artery stenosis, and can be used for detecting the lesions in animal models of peripheral vascular diseases.

Ultra-high frequency ultrasound; Diameter stenosis rate; Peak systolic low velocity (PSV); Atherosclerosis; Area stenosis rate; Rabbit

張鋒(1982-)，女，博士研究生，E-mail： doctor_zf@163.com。

吳長(zhǎng)君(1964-)，女，博士，教授，從事超聲診斷學(xué)研究，E-mail： bccjw@sohu.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0019-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.005

2014-06-20