高現(xiàn)亮，羅華元，梅友坤，董石飛 ，羅 藝，饒 智，鐘永麗，蘭建強(qiáng),3**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

〈生理生化〉

多種食用菌粗提液對煙草病原菌的抑制效果*

高現(xiàn)亮1，羅華元2，梅友坤1，董石飛2，羅 藝1，饒 智2，鐘永麗1，蘭建強(qiáng)1,3**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

研究了11種食用菌水提液對異絲腐霉、黑脛病菌和青枯病病菌生長的抑制作用。取紅蔥、香菇、木耳、塊菌、黑牛肝、黃牛肝、美味牛肝菌、大紅菇、奶漿菌、青頭菌和虎掌菌等粉末分別與蒸餾水混合后攪拌破碎，采用0.45 μm微孔濾膜過濾和真空抽濾泵進(jìn)行抽濾，得到無菌提取液，對異絲腐霉、黑脛病菌和青枯病菌3種煙草病原菌的抑菌活性進(jìn)行了測試。結(jié)果表明,11種食用菌提取液對3種供試菌株的菌絲生長都有一定的抑制活性。對真菌的抑制率與提取液濃度存在一定的線性相關(guān)，其中紅蔥10%提取液對2種真菌菌株抑制率最高，達(dá)到100%。大紅菇提取液對煙草青枯病菌表現(xiàn)出農(nóng)用鏈霉素相當(dāng)?shù)囊志Ч荒虧{菌提取液對異絲腐霉的毒力最強(qiáng)，紅蔥和黑牛肝提取液次之，大紅菇提取液對異絲腐霉的毒力最弱；黑牛肝提取液對黑脛病菌的毒力最強(qiáng)，塊菌和紅蔥提取液次之，而1.7%美味牛肝菌提取液對黑脛病菌有促進(jìn)菌絲生長作用；奶漿菌提取液對黑脛病菌的毒力最弱?？梢?1種供試食用菌中確實(shí)存在抗植物病原菌物質(zhì)，為生物抑制劑的開發(fā)提供了依據(jù)。

食用菌；煙草；病原菌；抑制作用

農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展，“無公害”、“綠色”、“有機(jī)”農(nóng)產(chǎn)品已成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。2010年《有機(jī)煙葉》[2]云南地方標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，2011年9月，用有機(jī)煙葉卷制的卷煙“玉溪莊園”在中國隆重上市，標(biāo)志著有機(jī)煙葉的研發(fā)與產(chǎn)品生產(chǎn)在國內(nèi)全面啟動(dòng)[3]。隨著栽培條件的變化, 煙草的病蟲害危害也日益嚴(yán)重, 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年煙草病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失在7億元以上[4]。煙草病害是制約煙草質(zhì)量和品質(zhì)的重要因素，其發(fā)生的病害種類多，癥狀復(fù)雜，降低了吸煙的安全性。早在19世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)多種擔(dān)子菌子實(shí)體、食用菌深層發(fā)酵液和固體培養(yǎng)物水浸液對植物病毒有抑制作用[5-7]。研究報(bào)道從鐵椆與紅菇[8]、松乳菇[9]、松茸發(fā)酵物[10]、靈芝[11]、茶樹菇[12]、蒼耳[13]、花臉香蘑[14]、竹蓀菌[15]、雞腿菇[16]和金針菇[16]等多種食用菌中分離到抗菌活性成分。因此，篩選有效抑制植物病毒病害的大型真菌以及分離出其中的抗菌活性成分,對防治植物病蟲害具有重要的意義。

本文對11種食用菌蒸餾水提取液進(jìn)行了抑制煙草異絲腐霉病菌(PythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga)、黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)和青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)3種病原菌的測試，為生物農(nóng)藥的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試食用菌菌種共11種，包括紅蔥E.americanaMerr.ex Heyne、香菇Lentinusedodes、木耳Auriculariaauricula、塊菌Tubermelanosporum、黑牛肝BoletusaereusFr.ex Bull.、黃牛肝Termitomyceseurrhizus(Berk.) Heim、美味牛肝菌BoletusedulisBull ex Franch、大紅菇RussulaalutaceaFr.、奶漿菌Lactariusvolemus、青頭菌Russulavirescens(Schaeff.ex Zanted)Fr.和虎掌菌Sarcodonimbricatus等11種食用菌干樣，購自于云南昆明木水花野生菌批發(fā)市場。

供試病原菌菌種共3種，包括煙草異絲腐霉病菌PythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga、黑脛病菌Phytophthoraparasiticavar.nicotianae(Bredadehean) Tucker和青枯病菌Ralstoniasolanacearum(E.F.Smith) Yabuuchietal，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。

主要儀器及試劑：TTC、2,3,5-氯化三苯基四氮唑，由本實(shí)驗(yàn)室保存；超凈工作臺(tái)、烘箱、燒杯、移液槍、醫(yī)用真空抽濾泵、攪拌機(jī)、粉碎機(jī)、高壓滅菌鍋等實(shí)驗(yàn)器材。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活性成分的提取

11種食用菌子實(shí)體去雜、洗凈，65℃烘干，粉碎備用。各取5 g子實(shí)體粉稱重后置于燒杯中，加入20倍重量蒸餾水，由于木耳提取液比較黏稠，按1∶50的比例加入250 mL蒸餾水，攪拌機(jī)攪拌加速溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾和真空抽濾泵進(jìn)行抽濾，得到無菌提取液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

燕麥培養(yǎng)基的制備：稱取燕麥50 g，加1 L水放入攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢?，再?層紗布進(jìn)行過濾，電磁爐上加熱燕麥液體，邊攪拌邊緩慢加入瓊脂粉20 g，使瓊脂粉完全溶解，再補(bǔ)足水至1 L，經(jīng)121℃高溫滅菌后冷卻至50℃左右。

TTC瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取蛋白質(zhì)10 g、水解酪蛋白1 g、葡萄糖10 g，加熱使其充分溶解于1 L水中，并邊攪拌邊緩慢加入瓊脂粉17 g，調(diào)節(jié)其pH，使pH在7.2左右。經(jīng)121℃高溫滅菌后冷卻至50℃左右，加入0.5%的TTC溶液1 mL搖勻。

1.2.3 病原真菌菌絲生長抑制實(shí)驗(yàn)

病原菌菌絲生長的抑制作用采用生長速率法。在無菌條件下，用移液槍分別移取制備好的不同無菌食用菌提取液6 mL、3 mL、1 mL，分別加入到54 mL、57 mL、59 mL且冷卻至45℃左右的燕麥培養(yǎng)基中搖勻，使其最終體積為60 mL，倒入3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿20 mL，分別得到含10%提取液成分、5%提取液成分、1.7%提取液成分的培養(yǎng)基。凝固后分別用孔徑為0.8 cm的打孔器，取菌落邊緣生長旺盛的菌種接種到含有提取物的燕麥培養(yǎng)基平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿接種1個(gè)菌餅，每個(gè)處理3次重復(fù)。以無菌水加入到培養(yǎng)基作為對照,然后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，每隔12 h進(jìn)行1次拍照、測量直徑，按照十字交叉法測量2次，以其平均值代表菌落直徑的大小。純生長量(D)、抑制率(P)的計(jì)算公式分別為：

D=d1-d2

P= (D1-D2)D1×100%

式中：d1表示菌落平均直徑(cm)；d2表示菌餅直徑(cm)；D1表示對照純生長量(cm)；D2表示處理純生長量(cm)。

1.2.4 青枯病菌生長抑制實(shí)驗(yàn)

采用濾紙圓片法測定食用菌提取液對青枯病菌菌絲生長的影響。使用打孔器在濾紙片上打39個(gè)直徑為0.8 cm的小圓片，裝在試管中進(jìn)行密封滅菌。超凈工作臺(tái)上，將滅好的濾紙片每3個(gè)為1組，放入各種食用菌提取液中浸泡4 h～5 h，以蒸餾水為空白對照，配制的等體積農(nóng)用鏈霉素為農(nóng)藥對照，共計(jì)13個(gè)處理。操作方法是將配制好的一定濃度的菌懸液0.1 mL，與滅好菌的冷卻至50℃的TTC瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)充分搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，把經(jīng)過不同處理浸泡的濾紙片等距離放于培養(yǎng)基上，每皿3片，封口置于32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察測量抑菌圈直徑。抑制率(P)的計(jì)算公式為：

P=(d3-0.8)- (d4-0.8)(d3-0.8)×100%

式中：d3表示對照直徑(cm)；d4表示處理直徑(cm)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010處理，采用DPSv6.55版本進(jìn)行毒力回歸分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 11種食用菌提取液對2種煙草真菌菌絲生長的抑制作用

不同濃度食用菌提取液對煙草異絲腐霉、黑脛病菌絲生長的抑制率見表1、表2。從實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果(表1和表2)可以看出，11種食用菌提取液在實(shí)驗(yàn)濃度下，對2種煙草真菌菌絲生長有不同程度的抑制作用。抑制率隨濃度的降低而降低，不同食用菌提取液之間對同一種病原真菌的抑制率也有差異。其中，紅蔥10%提取液對2種煙草病原真菌的抑制率均達(dá)100%。而奶漿菌提取液對異絲腐霉的抑制率最低，黃牛肝提取液對黑脛病菌的抑制率最低。美味牛肝菌提取液在1.7%濃度有促進(jìn)黑脛病菌菌絲生長的作用。

2.2 11種食用菌提取液對煙草真菌病原菌的毒力

11種食用菌提取液對煙草異絲腐霉病菌的毒力回歸分析結(jié)果見表3。

從表3可以看出，奶漿菌提取液對異絲腐霉的毒力作用最強(qiáng)，EC50為0.06%，大紅菇提取液對異絲腐霉的毒力最弱，EC50為2 287.56%。11種食用菌提取液對異絲腐霉的毒力大小依次為奶漿菌提取液>紅蔥提取液>黑牛肝提取液>塊菌提取液>木耳提取液>美味牛肝菌提取液>虎掌菌提取液>黃牛肝提取液>香菇提取液>青頭菌提取液>大紅菇提取液。11種食用菌提取液對煙草黑脛病菌的毒力回歸分析結(jié)果見表4。

表1 不同濃度食用菌提取液對煙草異絲腐霉菌絲生長的抑制率

注：表中同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(p=0.05)。

表2 不同濃度食用菌提取液對煙草黑脛病菌絲生長的抑制率

注：表中同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(p=0.05)。

表3 11種食用菌提取液對煙草異絲腐霉病菌的毒力回歸分析

表4 11種食用菌提取液對煙草黑脛病菌的毒力回歸分析

續(xù)表

食用菌回歸方程相關(guān)系數(shù)EC50∕%95%置信區(qū)間黃牛肝Y=3.0280+1.0018X0.9293.016.98～1239.66奶漿菌Y=3.9457-0.0676X-0.190.000.00～2698E+149大紅菇Y(jié)=4.0774-0.0926X0.809131176660.000.00～6.47E+23虎掌菌Y=3.4021+0.7643X0.88123.193.13～4844.37青頭菌Y=3.4179+1.3887X0.9613.786.38～29.75

從表4可以看出，黑牛肝提取液對黑脛病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為1.18%，奶漿菌提取液對黑脛病菌的毒力最弱，EC50為0.00%。11種食用菌提取液對異絲腐霉的毒力大小依次為黃牛肝提取液>黑牛肝提取液>紅蔥提取液>塊菌提取液>木耳提取液>美味牛肝菌提取液>青頭菌提取液>香菇提取液>虎掌菌提取液>大紅菇提取液>奶漿菌提取液。

從表3和表4可以看出，同一種食用菌提取液對不同煙草真菌的毒力作用相差較大。

2.3 11種食用菌提取液對青枯病病菌菌絲生長的影響

不同食用菌提取液對煙草青枯病菌的抑菌作用見表5。

表5 不同食用菌提取液對煙草青枯病菌的抑菌作用

從表5可以看出，不同食用菌提取液對煙草青枯病菌均有一定的抑制作用。經(jīng)分析各種食用菌提取液的抑菌效果與對照比較均有顯著差異，大紅菇提取液對煙草青枯病菌表現(xiàn)出與農(nóng)用鏈霉素相當(dāng)?shù)囊志Ч?，抑制率?75.00%，木耳提取液對煙草青枯病菌的抑菌效果較差，抑制率為65.00%。

3 討論

食用菌中多糖、脂類、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)含量豐富，王先彬[ 7]對香菇培養(yǎng)物水浸液進(jìn)行了詳細(xì)研究，證明了其對煙草花葉病毒有鈍化作用,因此證明食用菌中確實(shí)存在各種真菌及病毒的抑制物。本實(shí)驗(yàn)初步研究了11種食用菌提取液對3種煙草病原菌的抑制作用。紅蔥為鶯尾科紅蔥屬植物，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前已從紅蔥屬中分離出蔡酚類、蔡釀?lì)惡推咸烟俏纛惖仁畮讉€(gè)化合物，其中的一些成分具有增加冠狀動(dòng)脈血流量、抑制人體拓?fù)洚悩?gòu)酶等多種藥理活性[17]，潘俊等[18]首次報(bào)道了紅蔥對百合炭疽病的抑菌活性，而紅蔥、黑牛肝和塊菌等對煙草病原菌的抑菌活性此前未見報(bào)道。本文中活性篩選只是初期的研究指導(dǎo)，需要跟蹤分離找到其它活性化合物后進(jìn)一步驗(yàn)證，并對其構(gòu)效關(guān)系和機(jī)理進(jìn)行深入研究。

由本實(shí)驗(yàn)可知，紅蔥和黑牛肝提取液對真菌的抑制率高，毒力相對也高，毒力與抑制率之間存在著正相關(guān)。但是，奶漿菌提取液對異絲腐霉的抑制率較弱，毒力卻是最強(qiáng)的，它們之間存在著負(fù)相關(guān)。對于某一種特定的藥劑來說，毒力與抑制率之間究竟存在怎樣的相關(guān)性，需要進(jìn)一步探索和研究。

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Inhibition Effect of Extracts on Pathogenic Fungi in Tobacco from Edible Mushroom Varies

GAO Xian-liang1, LUO Hua-yuan2, MEI You-kun1, Dong Shi-fei2, LUO Yi1, RAO Zhi2, ZHONG Yong-li1, LAN Jian-qiang1,3

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, KunmingYunnan650201; 2.Hongyun-Honghe Group Co., LTD, KunmingYunnan650231; 3.College of Tobacco, Yunnan Agricultural University, KunmingYunnan650201)

The inhibition effect of the extracts from eleven species of mushroom, such asE.americanaMerr.ex Heyne,Lentinusedodes,Auriculariaauricula,Tubermelanosporum,BoletusaereusFr.ex Bull.,Termitomyceseurrhizus(Berk.) Heim,BoletusedulisBull ex Franch,RussulaalutaceaFr.,Lactariusvolemus,Russulavirescens(Schaeff.ex Zanted)Fr. andSarcodonimbricatus, on the growth ofPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga,Phytophthoraparasiticavar.nicotianaeandRalstoniasolanacearumwas experimented. The powder of the eleven species of edible mushroom were mixed with distilled water and stirred broken, filtered by 0.45 m micro porous membrane and vacuum pump filter to obtain sterile extract. The inhibition effect of the extracts on three species of fungi was tested. The results showed that the extracts from the eleven edible mushrooms could inhibit the hyphae growth of the three kinds of pathogenic fungi, and the fungal inhibition effect was the linear correlation with the concentration of extracts. The inhibition effect of the extracts fromE.americanaMerr.ex Heyne on 2 fungal strains was the highest, reaching to 100%. The extracts fromRussulaalutaceaFr. had better inhibition effect onRalstoniasolanacearumthan others, and 1.7%BoletusedulisBull ex Franch extract could even promote the hyphae growth ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianae. TheLactariusvolemusextract had highest toxicity onPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga, followed byE.americanaMerr.ex Heyne extract andBoletusaereusFr.ex Bull. TheRussulaalutaceaFr. extract had lowest toxicity. TheBoletusaereusFr. ex Bull extract had highest toxicity onPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga, followed byE.americanaMerr.ex Heyne extract andTubermelanosporum. TheLactariusvolemusextract had lowest toxicity. There were the anti-pathogenic materials in eleven species of mushroom, which could lay the foundation for the development of bio-inhibitor.

Edible mushroom; Tobacco; Pathogenic fungi; Inhibition effect.

*項(xiàng)目來源：云南中煙資助項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)體系建設(shè)”(2011JC-2)。

高現(xiàn)亮(1987-)，男，在讀碩士研究生，主要從事生物農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail: 644187390@qq.com

**通信作者： 蘭建強(qiáng)，男，副教授，主要從事煙草病害防治和生物農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail: jqlan92@163.com

2014-03-26

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0034-04