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        丁草胺污染對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響

        2014-07-16 05:40:48張仕穎夏運(yùn)生肖煒崔曉龍王永霞史靜張乃明
        關(guān)鍵詞:固氮菌草胺放線菌

        張仕穎,夏運(yùn)生,肖煒,崔曉龍,王永霞,史靜,張乃明*

        1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,云南 昆明 650201;2. 云南大學(xué)云南省微生物研究所,云南 昆明 650091

        云南永勝濤源鄉(xiāng)是保持我國(guó)水稻小面積超高產(chǎn)紀(jì)錄的特殊生態(tài)區(qū)。大量研究表明,這里不斷刷新的水稻高產(chǎn)紀(jì)錄得益于當(dāng)?shù)氐锰飒?dú)厚的自然生態(tài)條件(Ying等, 1998a;Ying等, 1998b;Katsura等, 2008;Li等, 2009),尤其是土壤微生物,在其中起到至關(guān)重要的作用(段紅平等,2007;李進(jìn)學(xué)等,2007)。土壤微生物與土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性存在關(guān)聯(lián)(Tilman等, 1996;Griffiths等, 2000),并且具有改善土壤質(zhì)量,提高生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的功能(Aboim等, 2008),因此可將土壤微生物作為靈敏的反映指標(biāo),表征土壤質(zhì)量的演變趨勢(shì)(張乃明,2013)。丁草胺是亞洲應(yīng)用最廣泛的苯乙酰胺類除草劑(Kumari等, 2009),與乙草胺和草甘膦并稱我國(guó)三大除草劑(Xu等, 2005)。丁草胺主要應(yīng)用于水稻田,對(duì)禾本科雜草有較好的防除效果,但由于使用量大,且直接毒土,不可避免地會(huì)在土壤和環(huán)境中殘留,破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu),影響水稻產(chǎn)量(余保文和朱誠(chéng),2008;韓玉軍和趙長(zhǎng)山,2012)。濤源特殊生態(tài)區(qū)常年使用丁草胺作為水稻選擇性芽前除草劑,大量施用的除草劑究竟會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成多大影響成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。目前關(guān)于丁草胺對(duì)普通水稻土微生物區(qū)系影響的研究較多(Min等, 2001;Suseela, 2001;Chen等,2009),但針對(duì)高產(chǎn)水稻土僅見(jiàn)從微生物功能多樣性角度探索的相關(guān)報(bào)道(張仕穎等,2013)。本研究重點(diǎn)關(guān)注土壤微生物3大類群和3類常見(jiàn)有益功能微生物,探討模擬條件下丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響,可為系統(tǒng)評(píng)價(jià)丁草胺的生態(tài)毒理效應(yīng)提供基礎(chǔ)研究資料。

        1 材料與方法

        1.1 供試藥品

        50%丁草胺乳油,上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn),農(nóng)藥登記號(hào):D20091403,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào):HG 3292—2001;施用方法:藥土法。

        1.2 土壤含水量測(cè)定

        稱取30~40 g(精確到0.01 g)新鮮土樣置于培養(yǎng)皿中,放入110 ℃烘箱烘烤6 h,取出稱質(zhì)量;之后重新放回烘箱繼續(xù)烘烤,每隔30 min重復(fù)稱質(zhì)量一次,直至恒質(zhì)量,設(shè)置3個(gè)重復(fù)。土壤含水量計(jì)算公式為:

        其中:m0表示烘干前樣品質(zhì)量,g;m1表示烘干后樣品質(zhì)量,g;wH2O表示土壤含水量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),%)。

        1.3 丁草胺處理

        丁草胺的合理施用標(biāo)準(zhǔn)為有效成分濃度747~1278 g·hm-2(國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局,2002),折算合每千克干土 0.216~0.370 mg,本研究取中間質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30 mg·kg-1作為100%推薦劑量。稱取相當(dāng)于500 g干質(zhì)量的新鮮土樣,加入超純水使其含水量為田間最大持水量的 60%,在室內(nèi)模擬條件下,添加以超純水稀釋的丁草胺乳油,使其在土樣中的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 50%推薦劑量(0.15 mg·kg-1,簡(jiǎn)稱 B15)、100%推薦劑量(0.30 mg·kg-1,簡(jiǎn)稱 B30)和 500%推薦劑量(1.5 mg·kg-1,簡(jiǎn)稱B150),攪拌均勻,另設(shè)不加丁草胺的處理為對(duì)照(0 mg·kg-1,簡(jiǎn)稱CK),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。所有處理密封,置于恒溫培養(yǎng)箱(25±1)℃中避光培養(yǎng),于藥劑處理后7、15、30、45 d取樣測(cè)定,每隔2~3 d用差減法補(bǔ)充水分以調(diào)節(jié)含水量,供試土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.89 g·kg-1,全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.30 g·kg-1,全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.67 g·kg-1,堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為101.65 mg·kg-1,有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.80 mg·kg-1,速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 142.91 mg·kg-1,pH 7.84。

        1.4 樣品測(cè)定方法

        分離好氧細(xì)菌(aerobic bacteria)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、真菌(fungi)使用馬丁氏培養(yǎng)基、放線菌(actinobacteria)使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基,分離自生固氮菌(nitrogen fixing bacteria)使用 Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基、磷酸鹽溶解菌(phosphate solubilizing bacteria)使用無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌(silicate dissolving bacteria)使用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基(國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局,2006;鐘傳青,2004),所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)至pH 7.5~8.0。

        1.5 數(shù)據(jù)處理

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理,采用單因素(one way ANOVA)方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌數(shù)量的影響

        從圖1可以看出,不同施藥濃度對(duì)好氧細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生的影響不完全相同。施藥7 d,100%和 500%推薦劑量表現(xiàn)出明顯的刺激促生長(zhǎng)作用,B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量均與CK達(dá)到顯著差異,比CK分別高出78.6%和153.8%;施藥15 d和30 d,B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量迅速下降至CK以下,表現(xiàn)出抑制好氧細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖的態(tài)勢(shì);施藥45 d,抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng),B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量已經(jīng)顯著低于 CK;此外,50%推薦劑量B15的好氧細(xì)菌數(shù)量則變化不大,4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)均顯示與CK基本保持在同一水平,沒(méi)有出現(xiàn)明顯的波動(dòng)??v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期,中、高濃度丁草胺對(duì)土壤好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的作用,低劑量丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌生長(zhǎng)則沒(méi)有太大影響。

        圖1 不同濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of different concentration of butachlor on bacteria number

        2.2 丁草胺對(duì)放線菌數(shù)量的影響

        從圖2可以看出,施藥7 d,B150表現(xiàn)出明顯的刺激促生長(zhǎng)作用,其放線菌數(shù)量顯著高于 CK,差值達(dá)到75.1%,B15和B30則表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其放線菌數(shù)量顯著低于 CK,差值分別達(dá)到74.5%和69.1%;施藥15 d,B150的刺激作用和B15的抑制作用明顯減弱,恢復(fù)到與CK相當(dāng)水平,B30則表現(xiàn)出對(duì)放線菌生長(zhǎng)明顯的刺激作用,其放線菌數(shù)量比CK高出125.0%,達(dá)到顯著差異;之后所有丁草胺處理的放線菌數(shù)量均保持在顯著低于CK的水平,表現(xiàn)出明顯的抑制作用??v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期,中高濃度丁草胺對(duì)放線菌的生長(zhǎng)有明顯的刺激作用,丁草胺濃度越高,刺激作用表現(xiàn)得越快越明顯,之后隨著丁草胺的自然降解,刺激作用逐漸轉(zhuǎn)化為抑制作用,低濃度丁草胺對(duì)放線菌生長(zhǎng)則主要表現(xiàn)為抑制作用。

        圖2 不同濃度丁草胺對(duì)放線菌數(shù)量的影響Fig. 2 Effect of different concentration of butachlor on actinomyces number

        圖3 不同濃度丁草胺對(duì)真菌數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of different concentration of butachlor on fungi number

        2.3 丁草胺對(duì)真菌數(shù)量的影響

        從圖3可以看出,不同濃度丁草胺對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響不同。施藥7 d,B30和B150顯著低于CK,表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其真菌數(shù)量分別比CK低16.8%和43.6%;施藥15 d,B30的真菌數(shù)量顯著提高,超過(guò)CK56.9%,其余2個(gè)處理則與CK沒(méi)有顯著差異;施藥30和45 d,B15和B30的真菌數(shù)量與CK處在同一水平,沒(méi)有明顯差異,B150則顯著低于CK,30 d時(shí)比CK低27.8%,45 d時(shí)比CK低22.7%。縱觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期,低濃度丁草胺B15對(duì)土壤真菌的生長(zhǎng)和增殖基本沒(méi)有影響,中等濃度B30則表現(xiàn)為先抑制后刺激的作用,隨著丁草胺的自然降解,抑制和刺激作用都會(huì)消失,其真菌數(shù)量可恢復(fù)到CK水平;高濃度丁草胺B150則始終表現(xiàn)為抑制作用,其真菌數(shù)量與CK之間存在明顯差異。

        圖4 不同濃度丁草胺對(duì)自生固氮菌數(shù)量的影響Fig. 4 Effect of different concentration of butachlor on nitrogen-fixingbacteria number

        2.4 丁草胺對(duì)自生固氮菌數(shù)量的影響

        從圖 4可以看出,不同劑量丁草胺施入土壤對(duì)自生固氮菌均表現(xiàn)為先刺激、后抑制的作用。施藥7 d,所有丁草胺處理自生固氮菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照,B15、B30和 B150比 CK分別高出237.1%,179.9%和138.1%,刺激作用顯著。施藥15 d,中低劑量處理自生固氮菌數(shù)量仍顯著高于CK,但刺激作用明顯減弱,B15和 B30分別比CK高出55.9%和20.9%,B150自生固氮菌數(shù)量則下降至與CK無(wú)顯著差異,高劑量刺激作用消失。施藥30 d,B15和B30自生固氮菌數(shù)量繼續(xù)下降,與CK無(wú)顯著差異,B150則繼續(xù)下降至CK以下29.6%,達(dá)到差異顯著,此時(shí)中低劑量丁草胺對(duì)自生固氮菌的促生長(zhǎng)作用已消失,高劑量則表現(xiàn)出對(duì)自生固氮菌的抑制作用。施藥45 d,基本情況與30 d時(shí)相似,中高劑量處理自生固氮菌數(shù)量進(jìn)一步減少,B30和 B150比 CK分別低 20.5%和35.9%,抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

        2.5 丁草胺對(duì)磷酸鹽溶解菌數(shù)量的影響

        圖5 不同濃度丁草胺對(duì)磷酸鹽溶解菌數(shù)量的影響Fig. 5 Effect of different concentration of butachlor on phosphate solubilizing bacteria number

        圖6 不同濃度丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響Fig. 6 Effect of different concentration of butachlor on silicate dissolving bacteria number

        從圖5可以看出,不同濃度丁草胺施入土壤會(huì)對(duì)磷酸鹽溶解菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用??v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期,500%推薦劑量B150的磷酸鹽溶解菌數(shù)量始終處于一個(gè)較低的水平,磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖受到強(qiáng)烈抑制;100%推薦劑量B30的磷酸鹽溶解菌數(shù)量也始終顯著低于 CK,但其抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)不及 B150處理明顯;50%推薦劑量B15對(duì)磷酸鹽溶解菌則表現(xiàn)出微弱的抑制作用,雖然其磷酸鹽溶解菌數(shù)量在整個(gè)丁草胺處理時(shí)期均低于 CK,但都未達(dá)到顯著差異??梢?jiàn)施用丁草胺會(huì)對(duì)高產(chǎn)水稻土磷酸鹽溶解菌群落產(chǎn)生不利影響,能夠抑制磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖,且丁草胺濃度越高,抑制作用越明顯。

        2.6 丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響

        從圖6可以看出,丁草胺濃度不同,對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響也不同。縱觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期,50%推薦劑量B15的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量在施藥7 d時(shí)有一小幅增加,之后基本保持穩(wěn)定,但4次取樣均未與CK達(dá)到顯著差異;100%推薦劑量B30和500%推薦劑量 B150的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量則始終與CK保持顯著差異,B30的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量在4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)基本保持恒定,B150則在施藥7和15 d時(shí)較低,分別比CK低60.7%和58.1%,到施藥30 d后達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀況。可見(jiàn)高產(chǎn)水稻土的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量與丁草胺的施用濃度密切相關(guān),低濃度對(duì)硅酸鹽細(xì)菌影響不明顯,中高濃度對(duì)硅酸鹽細(xì)菌有抑制作用,且在丁草胺達(dá)到半衰期之前,濃度越高,抑制作用越明顯。

        3 討論

        由于丁草胺應(yīng)用范圍廣、使用量大,對(duì)土壤環(huán)境的影響較為直接,目前國(guó)內(nèi)外也有一些關(guān)于施用丁草胺后對(duì)土壤微生物區(qū)系影響的相關(guān)報(bào)道。在三大微生物數(shù)量方面,Min發(fā)現(xiàn)施用不同濃度丁草胺后,土壤放線菌數(shù)量顯著下降,細(xì)菌和真菌數(shù)量上升,22 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)丁草胺可導(dǎo)致真菌生長(zhǎng)遲滯(Min等, 2001);單敏發(fā)現(xiàn)10 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下細(xì)菌、真菌和放線菌均受到抑制,2~4 mg·kg-1丁草胺對(duì)放線菌生長(zhǎng)有刺激作用(單敏等,2005);趙蘭則發(fā)現(xiàn)低濃度對(duì)細(xì)菌有刺激作用,20 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)放線菌有抑制作用,各濃度處理對(duì)真菌均表現(xiàn)為先抑制后刺激(趙蘭和黎華壽,2008)。在功能微生物數(shù)量方面,施用丁草胺可影響解磷微生物的生長(zhǎng)和活性(Dennath等, 2002),刺激水解發(fā)酵性細(xì)菌(Min等, 2001)、硫酸鹽還原細(xì)菌(Min等, 2001;陳中云等,2004)和反硝化細(xì)菌(Min等, 2001;陳中云等,2003a)生長(zhǎng),抑制產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌(Min等, 2001)生長(zhǎng),對(duì)甲烷產(chǎn)生菌的影響則與濃度相關(guān),低濃度加速生長(zhǎng),高濃度抑制生長(zhǎng),施藥7 d時(shí)抑制作用最大(Min等, 2001;陳中云等,2003b)。此外,研究者還通過(guò)乙炔還原法和液體培養(yǎng)最大或然計(jì)數(shù)法測(cè)定了水稻土中厭氧固氮菌和反硝化細(xì)菌的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)施用丁草胺后可加強(qiáng)微生物群落的固氮作用(Min等, 2001;Suseela, 2001;Chen等, 2009)和反硝化作用(Min等, 2001)。雖然研究者采用不同濃度組合進(jìn)行模擬試驗(yàn),但結(jié)果仍有共性,綜合前人和本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),施用丁草胺會(huì)對(duì)土壤微生物區(qū)系造成影響,影響方向和影響程度與微生物種類和丁草胺濃度密切相關(guān)。

        平板培養(yǎng)法是微生物研究中最經(jīng)典也最行之有效的方法之一,其優(yōu)勢(shì)在于可獲得微生物純菌株,并可計(jì)算自然樣品中可培養(yǎng)的活的微生物數(shù)目,在研究微生物種群結(jié)構(gòu)、生理生化特性、遺傳育種以及開(kāi)發(fā)利用微生物資源方面具有不可取代的重要地位。因此,即使在分子生物學(xué)手段日新月異的今天,對(duì)自然界微生物的研究依舊離不開(kāi)傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)手段。但同時(shí)必須指出,平板培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件系人為限定,常會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)條件的原因造成某些微生物的富集生長(zhǎng)和另一些微生物的缺失,在一定程度上影響著對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性,且自然界能夠被培養(yǎng)的微生物一般只占微生物總量的1%~10%(Daniel, 2005;Torsvik和Ovreas,2002),絕大數(shù)微生物可以在自然環(huán)境中存在,卻無(wú)法在人工條件下生長(zhǎng)(張洪勛等,2003),因此還需結(jié)合其它生物技術(shù)方能客觀而全面地反映微生物群落的真實(shí)信息(孔維棟等,2004)。

        4 結(jié)論

        本研究通過(guò)分析模擬條件下丁草胺污染對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響,得到以下結(jié)論。

        1)中高濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌具有先刺激生長(zhǎng)、后抑制活性的作用,低濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖影響不明顯。

        2)中高濃度丁草胺對(duì)放線菌有刺激作用,且濃度越高,刺激作用表現(xiàn)得越快越明顯,低濃度丁草胺對(duì)放線菌則主要表現(xiàn)為抑制作用。

        3)低濃度丁草胺對(duì)真菌的生長(zhǎng)和增殖基本沒(méi)有影響,中等濃度有先抑制后刺激的作用,高濃度丁草胺則始終表現(xiàn)為對(duì)真菌的抑制作用。

        4)不同濃度處理丁草胺均能刺激自生固氮菌的數(shù)量顯著增加,但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),高濃度開(kāi)始表現(xiàn)出抑制作用。

        5)不同濃度丁草胺均能抑制磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖,且丁草胺濃度越高,抑制作用越明顯。

        6)低濃度丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌的數(shù)量影響不明顯,中高濃度則對(duì)其有抑制作用,且濃度越高抑制作用越明顯。

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