劉秀斌，張瑩，曾建國，喬立瑞，黃靜，kate Yu

(1.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長沙 410004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128； 3.沃特世科技(上海)有限公司，上海 201206；4.沃特世科技有限公司，馬薩諸塞州，美國 01757)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉。銀杏葉性味甘苦澀平，有益心斂肺、化濕止瀉、降低血黏度、清除自由基等功效，其主要化學(xué)成分為總黃酮醇苷與萜類內(nèi)酯類[1–3]。

周恩麗等[4]對不同生長時(shí)期銀杏葉中的總內(nèi)酯進(jìn)行研究的結(jié)果表明，5月銀杏葉中的總內(nèi)酯含量最高，7月后呈下降趨勢。但無論是已報(bào)道的文獻(xiàn)還是中國藥典對銀杏葉的采集時(shí)間均沒有明確的說明與規(guī)定。不同采收期銀杏葉的化學(xué)成分的差異導(dǎo)致銀杏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制。

以往對藥材質(zhì)量控制研究僅局限于某幾個(gè)特征成分，忽略了其他成分的變化，而代謝組學(xué)從植物生物體系的整體性和動態(tài)性出發(fā)，研究植物次生代謝產(chǎn)物在生命過程中的動態(tài)變化規(guī)律，可從整體上科學(xué)評價(jià)和控制不同生長時(shí)期藥材的質(zhì)量。 筆者基于UPLC–QTOF MSE的代謝組學(xué)研究方法，系統(tǒng)地分析不同采收期銀杏葉中化學(xué)成分的差異，確定銀杏葉的合適采收期，旨在為科學(xué)制定銀杏葉質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

銀杏葉采自湖南瀏陽于2003年種植的銀杏樹苗圃。于2010年5月1日到9月15日，每隔15 d采收1次樣品，得到10個(gè)不同生長時(shí)期的鮮銀杏葉樣品。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

取新鮮銀杏葉，加入約5 倍水打漿后，在80℃下浸提2次 ，每次提取2 h，過濾得提取液。合并濾液，用殼聚糖澄清處理，加于已處理好的AB–8大孔吸附樹脂柱上，依次用5 倍柱體積水、4 倍柱體積70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥( 55 )℃，粉碎，得粉末狀樣品。將以上得到的粉末狀樣品溶解到甲醇與丙酮體積比為9∶1 的溶液中，其終質(zhì)量濃度為10mg/mL，然后稀釋10 倍量至 1mg/mL，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.2.2 樣品分析條件

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC 系統(tǒng)進(jìn)行液相分離。色譜柱的型號為ACQUITY UPLC HSS T3，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱溫55℃；流動相A(0.1% Formic Acid Water)、B(MeOH)；流速為0.5mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；A 的洗脫梯度為75%～10% (1～16min), 16.1～17min 用100%B 沖洗色譜柱，17min 后返回初始濃度平衡色譜柱4min。

質(zhì)譜條件：采用Waters Xevo Q–TOF Mass Spectrometer、電噴霧離子源負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔電壓40 V；離子源的溫度150℃；脫氣流速800 L/h；溫度550℃；數(shù)據(jù)采集模式為MSE，設(shè)定一低碰撞電壓 (Low CE)為5 eV，高碰撞電壓(High CE)為15～25 eV。采用亮氨酸腦非酞作為校正溶液，[M–H]–: 554.261 5。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

通過應(yīng)用軟件MarkerLynx V4.1 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先將三維的LC/MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二維矩陣，將每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)轉(zhuǎn)換成精確質(zhì)量和保留時(shí)間(EMRT)的數(shù)據(jù)對；再通過多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中相關(guān)參數(shù)的設(shè)置，該變量表可以直接通過SMICA–P(V11.5)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件來分析，即可對A組內(nèi)所有樣品(A1～A10)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析參數(shù)設(shè)定為：保留時(shí)間1～18min；質(zhì)譜范圍50～1 500 amu；質(zhì)譜允許偏差0.05 amu；噪音消除水平6.0；強(qiáng)度閾值100；質(zhì)譜窗口0.05 amu；保留時(shí)間0.2min。

2 結(jié)果與分析

為了更有效地獲取銀杏葉中化合物的相關(guān)信息，需先進(jìn)行色譜分離條件的系統(tǒng)優(yōu)化。本研究中通過對流動相進(jìn)行細(xì)致的考察，實(shí)現(xiàn)了樣品中大量化合物的有效分離。從圖1 可以看出，銀杏樣品的組分極性范圍很寬，從高極性到低極性的化合物均能在總離子圖中有所體現(xiàn)，如在0～8min 主要集中的是極性大的組分；在12～18min 主要集中的是極性較小的部分。8～12min 期間組分峰較少，可能是由于該時(shí)間段內(nèi)化合物較少或組分離子化程度不高。

通過UPLC 串聯(lián)Q–TOF 的分析方法，并采用了MSE的采集模式，在一次進(jìn)樣分析中，不僅能夠得到樣品中所有化合物的一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，同時(shí)也能夠得到對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)能夠提供化合物的母離子信息，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供相應(yīng)化合物的子離子的信息。該數(shù)據(jù)采集模式的高通量特性為后期的大量化合物數(shù)據(jù)的分析奠定基礎(chǔ)。

圖1 采用MSE 的采集模式同時(shí)得到的一級和二級質(zhì)譜圖 Fig.1 MS and MS/MS spectra obtained by MSE acquisition mode

通過上述方法得到含有三維信息(保留時(shí)間、質(zhì)荷比及響應(yīng)強(qiáng)度)的數(shù)據(jù)。每個(gè)三維數(shù)據(jù)信息代表一個(gè)化合物，共得到1 425個(gè)以二維矩陣型式(EMRT)列出的數(shù)據(jù)對。由于試驗(yàn)得出的銀杏葉中化合物的信息量大，采用手動的數(shù)據(jù)分析方法工作量大、耗時(shí)長，因此，使用多元統(tǒng)計(jì)的主成分分析法(PCA)[5–7]對LC/MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

將上述1 425個(gè)數(shù)據(jù)對組成的變量表直接通過SMICA–P 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成不同生長時(shí)期內(nèi)所有樣品(A1～A10)的統(tǒng)計(jì)分析，如主成分分析(PCA)圖2–A 中所示：從春季到夏季再到秋季，其對應(yīng)的樣品成分隨著季節(jié)的不同有著明顯的變化規(guī)律，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)樣品。通過PCA 的載荷圖(圖2–B)進(jìn)一步分析造成樣品成分變化明顯的原因，該圖中的每個(gè)點(diǎn)代表上述1 425個(gè)EMRT 中的1個(gè)離子對，而每個(gè)區(qū)域的離子對信息與樣品所在的象限是一一對應(yīng)的。從載荷圖中可以看出，距離中心較遠(yuǎn)的點(diǎn)是造成該季節(jié)樣品成分變化的主要貢獻(xiàn)者，如圖中紅框標(biāo)注的Markers 代表著引起秋季銀杏葉樣品與夏季、春季銀杏葉差異的標(biāo)志性化合物。同理，黃色框內(nèi)的代表著春季和秋季樣品里有顯著差異的Marker。

圖2 不同季節(jié)新鮮銀杏葉水提液的PCA 主成分分析圖(A)和載荷圖(B) Fig. 2 PCA score plot(A) and PCA Loading plot(B) of water extract of Fresh Ginkgo leaf in different seasons

為了深入研究春季與夏季、秋季銀杏葉樣品間 的組分差異，從圖3–A 可以明顯看到這些組分在春季的含量明顯高于其他時(shí)節(jié)，其中圖3–A 中藍(lán)色框內(nèi)保留時(shí)間為4.69min、m/z 為755.183 9 的這個(gè)潛在標(biāo)志物在銀杏葉中的含量從春季到夏季、秋季呈明顯的下降趨勢(圖3–B)。將這些春季含量高的特征標(biāo)記物(Marker)用Excel 文件保存下來(表1)。

圖3 載荷圖黃色框內(nèi)組分(A)和槲皮素對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷(B)在不同采收季節(jié)的含量變化趨勢 Fig.3 Change trends of the content of component in yellow box(A) and quercetin 3–O–2’’– (6’’’–p–coumaroyl)glucosylrhamnoside (B) in different harvest seasons

表 1 利用載荷圖中獲得區(qū)分春季和秋季樣品差異最高貢獻(xiàn)的12個(gè)精確質(zhì)量與保留時(shí)間的數(shù)據(jù)對列表 Table 1 List of the 12 quality precision data and retention time contributed highest to the difference that distinguish samples between spring and autumn using the load plot

為了對春季含量高的特征標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，將表 1 中這些 EMRT 數(shù)據(jù)對重新輸入MarkerLynx 列表中，通過軟件中元素組成分析功能計(jì)算分子式以及搜索數(shù)據(jù)庫。以保留時(shí)間4.69min的這個(gè)化合物為例，說明潛在標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)解析過程。[M–H]–精確分子量(m/z)為755.183 9，通過計(jì)算該化合物分子式為C36H35O18，利用MarkerLynx 軟件中自動搜索Chemispider 數(shù)據(jù)庫的功能及相關(guān)的文獻(xiàn)[8]報(bào)道，最終推測該化合物可能為槲皮素對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。根據(jù)該化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及二級碎片，軟件MassFragmentTM自動地對該化合物的裂解進(jìn)行推測，如圖4 所示。

圖4 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)裂解推導(dǎo) Fig. 4 Fragmentation of the target compound structure

3 討 論

本試驗(yàn)探索利用代謝組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對銀杏葉組分進(jìn)行綜合性評價(jià)，作了一種有意義的嘗試。研究結(jié)果表明，在不同采收季節(jié)采集的銀杏葉組分差異明顯，并呈規(guī)律性的變化，槲皮素對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏赛S酮醇苷類成分含量從春季到夏季、秋季呈下降趨勢，尤其在春季采收與在秋季采收有明顯的不同，因此，應(yīng)建立規(guī)范合理的銀杏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采收銀杏葉應(yīng)有季節(jié)說明，并加強(qiáng)對上市產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控。該研究結(jié)果可以為后期深入研究銀杏葉質(zhì)量與科學(xué)的規(guī)定采收時(shí)節(jié)提供參考和借鑒，同時(shí)也為其他中藥材的質(zhì)量評價(jià)和控制提供了一種新的模式和手段。

感謝鄭亞杰博士在論文修改過程中提供的幫助。

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