李連珍，薛春苗，張 冰，劉小青

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100029）

在藥性理論研究的過(guò)程中，證候模型的塑造和研究至關(guān)重要。虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型的建立和界定，近年來(lái)也進(jìn)行了大量研究[1-3]。虛寒狀態(tài)，臨床又稱為虛寒證或陽(yáng)虛證，是中醫(yī)臨床常見(jiàn)的一種證型，一般認(rèn)為是體內(nèi)陽(yáng)氣虛衰所致，其宏觀癥狀主要有四肢怕冷、身體蜷臥、畏寒、喜溫喜暖等。而“寒”的本義與客觀的溫度相關(guān)，陸明等[4-5]也發(fā)現(xiàn)虛寒證患者7處溫度與正常人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并認(rèn)為虛寒證肢冷患者的肢體溫度降低是由產(chǎn)能不足與儲(chǔ)能不足或生物利用度低下兩方面原因造成的，是一種整體的功能失調(diào)，故虛寒證患者可能涉及能量代謝障礙。那么虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型的能量代謝又會(huì)如何變化？本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上[6]，選擇氫化潑尼松誘導(dǎo)大鼠虛寒狀態(tài)，觀察虛寒狀態(tài)下大鼠肝臟能量代謝相關(guān)因子變化特點(diǎn)，為虛寒證動(dòng)物模型的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 注射用氫化潑尼松琥珀酸鈉（天津生物制藥有限公司生產(chǎn)，每只50 mg，批號(hào)：20100310），琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20100720），三磷酸腺苷酶（ATPase）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20100620），偶聯(lián)蛋白-2（UCP-2，兔一抗（博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司），DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器 2000UV紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)），Centrifuge5415D臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf產(chǎn)品），德國(guó)Hei dolph公司DIAX900型內(nèi)切式勻漿器，BS323S電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司），CX4型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司），XSP-2C生物顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 動(dòng)物 雄性SD大鼠，48只，體質(zhì)量240～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。

2 方法

2.1 分組處理 大鼠隨機(jī)分為兩組，即正常組和虛寒組，每組各24只。虛寒組每天上午8：00左右，后腿肌肉交替注射氫化潑尼松琥珀酸鈉生理鹽水溶液，20 mg/kg，正常組注射等體積生理鹽水。注射第14、第21天晚上8點(diǎn)，正常組和虛寒組各12只，禁食不禁水12 h，次日上午8點(diǎn)，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主靜脈取血，分離血清，測(cè)乳酸（LAC）。固定位置取一塊兒肝臟，4%多聚甲醛固定，每組動(dòng)物按號(hào)間隔取，每組取5個(gè)標(biāo)本，待測(cè)免疫組化。其余肝臟，-80℃凍存，待測(cè)SDH和ATP酶。

2.2 指標(biāo)檢測(cè) 血清LAC由貝克曼CX4型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。肝勻漿中SDH、ATP酶活性，按南京建成SDH、ATP酶測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)。肝臟UCP-2蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。將肝臟浸入4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，片厚5 μm；常規(guī)脫蠟和水化，92～98℃水浴熱修復(fù)30 min，冷卻至室溫，兔抗UCP-2單克隆抗體（1∶50）37℃ 2 h，二抗 37℃孵育 40 min，DAB 顯色。采用Imapage-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)UCP-2陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的面積及積分灰度值進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清LAC變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠血清LAC含量在造模第14天和第21天均明顯降低（P<0.05）。

表1 各組動(dòng)物血清LAC變化（±s）Tab.1 Change of serum LAC of animals in each group（±s） μmol/L

表1 各組動(dòng)物血清LAC變化（±s）Tab.1 Change of serum LAC of animals in each group（±s） μmol/L

注：與正常組比較，*P<0.05。

氫考劑量（mg/kg，肌注）正常組 12虛寒組 12組別 n 14 d 21 d-7.64±0.55 7.18±0.8320 5.25±0.17* 5.29±0.84*

3.2 肝組織SDH變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠肝組織勻漿中SDH活性在造模第14天和第21天均明顯降低（P<0.05）。

表2 各組動(dòng)物肝勻漿SDH變化（±s）Tab.2 Change of SDH in liver homogenate of animals in each group（±s）U/mg pro

表2 各組動(dòng)物肝勻漿SDH變化（±s）Tab.2 Change of SDH in liver homogenate of animals in each group（±s）U/mg pro

注：與正常組比較，*P<0.05。

組別正常組虛寒組n 氫考劑量（mg/kg，肌注）121214 d 21 d-3.76±0.58 5.02±1.2120 3.06±0.86* 4.10±0.60*

3.3 肝組織ATP酶變化 與同期正常組比較，虛寒組大鼠肝組織中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性在造模第14天有降低趨勢(shì)，Ca2+-Mg2+-ATP酶有升高趨勢(shì)，均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；虛寒組大鼠肝組織中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在造模第21天均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

表3 各組動(dòng)物肝勻漿ATP酶變化比較（±s，n=12）Tab.3 Change of ATPase in liver homogenate of animals in each group（±s，n=12）

表3 各組動(dòng)物肝勻漿ATP酶變化比較（±s，n=12）Tab.3 Change of ATPase in liver homogenate of animals in each group（±s，n=12）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 氫考劑量（mg/kg，肌注）Ca2+-Mg2+ATP酶- 2.36±0.41 1.50±0.27 1.67±0.55 2.61±0.5120 2.31±0.23 1.40±0.17 1.37±0.23 2.74±0.46- 3.95±0.76 4.14±0.76 3.89±0.91 4.12±0.8720 3.46±0.30*3.14±0.40**3.25±0.35*3.46±0.32*時(shí)間14 d Na+-K+ATP酶Mg2+ATP酶Ca2+ATP酶正常組虛寒組正常組虛寒組21 d

3.4 肝組織UCP-2表達(dá)變化 與正常組比較，虛寒組肝臟UCP-2的陽(yáng)性表達(dá)面積（Area）和積分光密度值（IOD）明顯降低（P<0.05）。

表4 各組動(dòng)物肝臟UCP-2蛋白表達(dá)的變化（±s）Tab.4 Change of the expression of protein of hepatic UCP-2 of animals in each group（±s）

表4 各組動(dòng)物肝臟UCP-2蛋白表達(dá)的變化（±s）Tab.4 Change of the expression of protein of hepatic UCP-2 of animals in each group（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05。

組別正常組虛寒組n 5 5氫考劑量（mg/kg，肌注） Area IOD-23.84±3.31 4.03±0.5220 18.48±1.79* 2.64±0.52*

4 討論

動(dòng)物模型的塑造和構(gòu)建，是中藥藥性理論實(shí)質(zhì)研究的基礎(chǔ)。虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型則與辛熱藥藥性表達(dá)研究密切相關(guān)。近年來(lái)，有關(guān)虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型的研究日益增多，課題組運(yùn)用數(shù)理分析方法對(duì)數(shù)百篇與虛寒動(dòng)物模型相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，選擇氫化潑尼松作為造模劑，制作虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型，并經(jīng)過(guò)大量研究，確定造模劑量及模型成功和穩(wěn)定時(shí)間[7-8]。在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇氫化潑尼松誘導(dǎo)虛寒狀態(tài)，以肝組織中SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、肝臟UCP-2蛋白表達(dá)，血清中LAC的含量作為指標(biāo)，探討虛寒狀態(tài)下肝臟能量代謝變化特點(diǎn)。

能量代謝指隨著生命現(xiàn)象或作為其原因的能量的出入或轉(zhuǎn)換能量代謝方面，在化學(xué)鍵能（呼吸、發(fā)酵）或光能（光合成）直接轉(zhuǎn)化成熱量前，轉(zhuǎn)換成ATP等的高能鍵是其顯著的特征之一。機(jī)體能量代謝包括能量的生成和能量的分解兩部分。SDH是線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中的酶，其活性增高表明三羧酸循環(huán)的加快，同時(shí)也標(biāo)志著細(xì)胞內(nèi)ATP生成增強(qiáng)，LAC則是糖酵解途徑的產(chǎn)物，也與能量的生成有關(guān)。ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶，是一類能將ATP催化水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子的酶，這是一個(gè)釋放能量的反應(yīng)，Na+-K+-ATP酶[9]、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶等酶的活性與能量代謝密切相關(guān)。王米渠等[10]研究發(fā)現(xiàn)寒證大鼠Na+-K+-ATP酶的活性比正常大鼠下降。張偉榮等[11]研究發(fā)現(xiàn)虛寒大鼠細(xì)胞能荷、肝臟Na+-K+-ATP酶活性、比虛熱大鼠低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虛寒狀態(tài)組血清LAC含量降低，肝組織中SDH活性降低，Na+-K+ATP酶、Mg2+ATP酶、Ca2+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性均明顯降低，提示虛寒狀態(tài)大鼠能量生成環(huán)節(jié)障礙。

此外，解偶聯(lián)蛋白家族（UCPs）作為一種線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)熱和能量代謝方面發(fā)揮著重要作用。UCP通過(guò)催化質(zhì)子的跨線粒體內(nèi)膜運(yùn)輸，降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，從而降低ATP生成，使產(chǎn)熱增加。UCP-2廣泛存在于動(dòng)物的骨骼肌、肝臟、腎臟、肺、胃及小腸等組織的線粒體內(nèi)膜上，它主要作用是通過(guò)消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度差，從而使氧化過(guò)程和ATP生成的磷酸化過(guò)程解偶聯(lián)，使得氧化過(guò)程釋放的能量全部以熱能形式散失[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示，肝臟UCP-2表達(dá)降低，提示虛寒機(jī)體處在能量代謝障礙狀態(tài)。

綜上，虛寒狀態(tài)大鼠血清LAC含量，肝組織中ATP酶活性和UCP-2表達(dá)降低?？梢?jiàn)，氫化潑尼松誘導(dǎo)的虛寒狀態(tài)動(dòng)物模型存在能量代謝障礙。在虛寒狀態(tài)模型的制作和研究中，應(yīng)注意能量代謝的相關(guān)變化，然能量代謝更深層的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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