劉崇靈，劉曉波，胡呈才，吳海超，李潤(rùn)成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

豬細(xì)小病毒病，是由豬細(xì)小病毒（PPV）引起的一種豬的繁殖障礙病。以懷孕母豬發(fā)生產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流產(chǎn)及病弱仔豬為特征，故又稱(chēng)豬繁殖障礙癥，此外還引起皮炎和腸炎。病毒于1967年Cartwright和Huck等人首先在不育、流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒中分離到并證實(shí)其病原作用[1]，其后歐洲、美洲、亞洲、非洲及大洋洲很多國(guó)家均有本病的報(bào)道，現(xiàn)已遍布全世界。到目前為止，我國(guó)在上海、黑龍江、吉林、四川、北京、江蘇、湖北、浙江、廣西、河北等地也均已分離到豬細(xì)小病毒[2～3]。由于豬細(xì)小病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，可在被污染的豬舍內(nèi)生存數(shù)月之久，所以容易造成長(zhǎng)期連續(xù)感染，難以清除，為養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。

豬細(xì)小病毒只能在來(lái)源于豬的細(xì)胞（包括原代豬腎、豬睪丸細(xì)胞核傳代系PK-15）和人的某些傳代細(xì)胞中培養(yǎng)增殖[4]。且如今SYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法。本研究旨在從不同接毒方式、細(xì)胞接種量、病毒感作時(shí)間以及接種濃度等方面進(jìn)行分析比較，并用SYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法對(duì)病毒滴度進(jìn)行測(cè)定，以期探討培養(yǎng)病變明顯的高滴度PPV病毒，為疫苗生產(chǎn)及大量制備抗原物質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 病毒及細(xì)胞

PPV病毒為本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存的PPV病毒NADL-2株細(xì)胞培養(yǎng)物；ST細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DMEM（HighGlucose）培養(yǎng)基以及0.25%Trypsin-EDTA均為為HyClone公司產(chǎn)品，新生犢牛血清為Gibco公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶為Corning公司產(chǎn)品，SYBRRPremixExTaqTM熒光定量試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品，配制雙抗用青霉素鈉（80萬(wàn)單位）為哈藥集團(tuán)制藥總廠產(chǎn)品，配制雙抗用硫酸鏈霉素（100萬(wàn)單位）為瑞陽(yáng)制藥有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 不同細(xì)胞覆蓋率對(duì)病毒滴度的影響

取一瓶長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞消化傳代并按不同比例稀釋至兩塊六孔板，使得六孔板底鋪上覆蓋率分別為100%、80%、67%、50%、33.3%、17%的細(xì)胞，分別用于同步接毒以及分步接毒。用于同步接毒的細(xì)胞板在細(xì)胞鋪板后同時(shí)加入已稀釋的病毒，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（含5%CO2）感作1h后加入2%血清維持細(xì)胞生長(zhǎng)；用于分步接毒的細(xì)胞板待細(xì)胞貼壁后加入已稀釋的病毒，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（含5%CO2）感作1h,棄去病毒液，補(bǔ)足含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)72h收毒。

2.2 不同接種濃度對(duì)病毒滴度的影響

將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞消化傳代后按相同比例均勻加入六孔板各孔，用不含新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋PPV病毒，稀釋倍數(shù)分別為101、102、103、104，105，將各稀釋病毒分別接種各孔細(xì)胞，并設(shè)平行對(duì)照孔以及不加病毒液的對(duì)照孔，于37℃感作1h后，棄病毒液，補(bǔ)足含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)72h收毒。

2.3 含不同濃度血清的維持液對(duì)病毒滴度的影響

待確定好最適細(xì)胞密度及病毒接種濃度后，將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞以最適細(xì)胞密度消化傳代至細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋病毒，將病毒稀釋至最適接種濃度后接種細(xì)胞，于37℃感作1h后，棄病毒液，分別補(bǔ)足不含血清、含1%血清、含2%血清的維持液，培養(yǎng)72h收毒。

2.4 不同感作時(shí)間對(duì)病毒滴度的影響

待確定好最適細(xì)胞密度及病毒接種濃度后，將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞以最適細(xì)胞密度消化傳代至細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋病毒，病毒分別感作30min、1h、2h后，棄病毒液，補(bǔ)足最適血清濃度維持液，培養(yǎng)72h收毒。

2.5 SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 鑒定

將上述各實(shí)驗(yàn)組在接毒72h后收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，并反復(fù)凍融三次，按照大連寶生物公司SYBRGreenⅠ熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)CT值，根據(jù)其CT值高低篩選各優(yōu)化條件。PPV熒光定量檢測(cè)引物為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成，引物序列為（5’-3’）:上游引 物（PPVfp2）- AACTGAACACGCAAAAGAC TACG-；下游引物（PPVrp1）-TCTCGGCGATC TTCTTACCTCTG。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同細(xì)胞覆蓋率對(duì)病毒滴度的影響結(jié)果

經(jīng)熒光定量PCR測(cè)得相對(duì)CT值結(jié)果比較，結(jié)果顯示分步接毒培養(yǎng)的病毒所測(cè)CT值均較同步接毒低，表明分步接毒病毒滴度高于同步接毒（見(jiàn)圖1）；而從細(xì)胞覆蓋率來(lái)看，同步接毒時(shí)在細(xì)胞覆蓋率為100%時(shí)接毒，病毒滴度較高，分步接毒時(shí)細(xì)胞覆蓋率在50%以上CT值相差不大，在覆蓋率為50%或100%時(shí)病毒滴度相對(duì)較高（見(jiàn)表1）。

3.2 不同接種濃度對(duì)病毒滴度的影響

經(jīng)熒光定量PCR測(cè)得相對(duì)CT值，結(jié)果顯示病毒以103倍稀釋接毒測(cè)得CT值最低，表明PPV病毒以103倍稀釋接毒病毒滴度最高（見(jiàn)表2）。

3.3 含不同濃度血清的維持液對(duì)病毒滴度的影響

經(jīng)熒光定量PCR測(cè)得相對(duì)CT值，結(jié)果顯示含2%血清的維持液所測(cè)CT值最低，表明維持液中含2%血清時(shí)病毒滴度最高（見(jiàn)表3）。

3.4 病毒不同感作時(shí)間對(duì)病毒滴度的影響

經(jīng)熒光定量PCR測(cè)得相對(duì)CT值，結(jié)果顯示病毒感作2h的實(shí)驗(yàn)組所測(cè)CT值最低，表明病毒感作2h時(shí)病毒滴度最高（見(jiàn)表4）。

4 討論

培養(yǎng)高滴度的PPV病毒對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)疫苗抗原來(lái)說(shuō)，應(yīng)該是在保證疫苗質(zhì)量的前提下的重要問(wèn)題，所以篩選最優(yōu)接毒工藝對(duì)于高滴度病毒的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)尤為重要，不僅能有利于大規(guī)模生產(chǎn)，也節(jié)約了成本。目前抗原的檢測(cè)方式有很多，而熒光定量PCR方法是目前較為準(zhǔn)確以及快速的檢測(cè)病原的方式，其優(yōu)勢(shì)在于不僅能定性還能定量，是確定培養(yǎng)高滴度病毒接毒條件的較為準(zhǔn)確及快速的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CT值的高低進(jìn)行相對(duì)定量，以篩選出能培養(yǎng)高滴度病毒的接毒工藝。

很多學(xué)者也對(duì)豬細(xì)小病毒的培養(yǎng)以及增殖特性進(jìn)行了研究[5～6]，研究發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒能在多種細(xì)胞上繁殖并產(chǎn)生明顯病變，且有實(shí)驗(yàn)表明PPV在ST細(xì)胞增殖不僅病變時(shí)間早且毒價(jià)高于PK-15細(xì)胞一個(gè)滴度左右[7]。豬細(xì)小病毒雖能自行復(fù)制，但能否增殖還取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)，它最適于在具有旺盛增殖能力并處在有絲分裂過(guò)程中的細(xì)胞內(nèi)增殖[4]，因此PPV的接種要求細(xì)胞傳代時(shí)同步接毒，最遲不晚于2/3時(shí)接種[8]，但也有研究報(bào)道PPV在不同細(xì)胞系上的增殖情況，表明PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于ST細(xì)胞，所以PK-15細(xì)胞依然采用同步接毒而ST細(xì)胞采用細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)分步接毒[9]。所以本實(shí)驗(yàn)采用ST細(xì)胞對(duì)PPV病毒進(jìn)行增殖，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分步接毒滴度高于同步接毒，而病毒滴度在分步接毒時(shí)細(xì)胞覆蓋率大于50%時(shí)趨于一致，在同步接毒時(shí)細(xì)胞覆蓋率在100%時(shí)即單層覆蓋時(shí)滴度最高，也表明由于ST細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，PPV可以在細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)接種ST細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同接毒方式、不同細(xì)胞覆蓋率、不同接種濃度、病毒感作時(shí)間、維持液血清濃度等方面進(jìn)行了分析及篩選，確定了將PPV以103倍稀釋分步接毒單層ST細(xì)胞，于37℃感作2h，棄病毒液后加入含2%新生牛血清的維持液的一套較好的培養(yǎng)高滴度病毒的接毒工藝，為大規(guī)模生產(chǎn)疫苗抗原提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1]Cartwright S F, Huck R A. Virus isolation is associated with herd infertility, abortion and stillbirth in pigs[J].Vet Rec, 1967, 81：196-197.

[2]李英霞,李長(zhǎng)宏,朱琪等.黑龍江省豬細(xì)小病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2001,37(1):22.

[3]楊待建, 金升藻. 湖北省豬細(xì)小病毒病流行的調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999, 21(5): 386-389.

[4]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］第2 版，北京：科學(xué)出版社，1997：1145-1151.

[5]白同臣,曲海波,吳金,等.影響豬腎細(xì)胞生長(zhǎng)及豬細(xì)小病毒增殖的因素淺探[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2008,44(5):69-70.

[6]張磊, 程磊, 丁靜靜, 等. 豬細(xì)小病毒在F81 細(xì)胞和PK15 細(xì)胞增殖的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2012, 44(003):59-61.

[7]莊金秋. 豬細(xì)小病毒在不同組織細(xì)胞上增殖特性的研究[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2005 (7): 47-48.

[8]殷華平, 郭萬(wàn)柱, 徐志文, 等. 豬細(xì)小病毒( PP V ) S C1 株的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006,(7):63-65.

[9]倪嬌, 趙建增, 劉長(zhǎng)輝, 等. 豬細(xì)小病毒在PK15 細(xì)胞中增殖規(guī)律的研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2009,43(1):21-24.