李 鑫，鄧 緣，燕海峰，高鳳仙，※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131）

為了對種蛋中的囊胚細(xì)胞進(jìn)行操作，且操作后種蛋需要能成功孵化出小雞，需對種蛋進(jìn)行開窗處理，據(jù)報(bào)道[1]，目前普遍采用赤道面開窗不換殼后的培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)研究開窗未注射和開窗注射組的孵化率無顯著性差異，但開窗組與正常對照組差異極顯著，開窗組孵化率大幅度下降的原因主要與開窗有關(guān)。因?yàn)殚_窗會導(dǎo)致雞蛋內(nèi)環(huán)境變化,導(dǎo)致雞胚發(fā)育畸形和致死，特別在胚胎發(fā)育早期，情況特別明顯。因此本研究主要對種蛋開窗方法進(jìn)行了改善，以期提高種蛋開窗后的孵化率。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

種蛋來源：白萊航雞的種蛋。

1.2 不同種蛋開窗方法對孵化率的影響

1.2.1 種蛋開窗技術(shù)。將試驗(yàn)種蛋用70%酒精表面進(jìn)行擦拭消毒。在無菌操作臺上，用開蛋器在雞蛋赤道面的殼面切出邊長約為5mm的三角形，先只切開外殼，其中一頭邊縫寬為其它縫寬的雙倍，便于翻開，同時(shí)在該寬縫下邊粘上約1mm2的雙面膠，用于割開切塊內(nèi)殼膜后，切塊能倒粘在雙面膠上。

開窗操作時(shí)，用10號解剖刀，劃開切縫較窄的兩邊的內(nèi)殼膜，用刀片將切塊挑起，通過雙面膠固定到種蛋殼上，以便于通過窗口對胚胎進(jìn)行操作。

1.2.2 種蛋的封口。 種蛋開窗后的封口設(shè)計(jì)了3種方法：

（1）方法I（粉+膠法）：沿切槽內(nèi)均勻填充聚乙烯粉，再使用液體膠（如502膠等）從槽中注入，并擴(kuò)散覆蓋到整個(gè)切槽。

（2）方法II(貼膜封口法)：使用醫(yī)用貼膜，以切塊為中心進(jìn)行粘貼，然后用解剖刀片刮平。

（3）方法III（膜+膠法）：先用醫(yī)用貼膜進(jìn)行封口，再沿膜邊沿用液體膠粘合。

1.2.3 種蛋的孵化。使用小型全自動孵化儀，孵化溫度為37.7℃，相對濕度為65%，每2h翻蛋1次，每次轉(zhuǎn)1角90°。孵化至19d，溫度調(diào)節(jié)到37℃，濕度調(diào)節(jié)到70%。孵化期間，分3個(gè)階段（6d、11d和17d）照蛋，孵化后收集不同時(shí)期胎胚死亡數(shù)、孵化數(shù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 不同操作者進(jìn)行種蛋開窗對孵化率的影響研究

選取操作熟悉程度不同的兩名操作者進(jìn)行種蛋開窗，均采用以上三種操作方法，并觀察不同操作者應(yīng)用不同封口方式對種蛋孵化率的影響。

1.4 開窗后通過添加不同溶液對種蛋孵化率的影響研究

種蛋開窗后，分3組進(jìn)行操作，分別為添加PBS溶液組、添加稀蛋清組和對照組，添加PBS溶液組和添加稀蛋清組盡可能完全排除空氣。封口辦法采用膜+膠的方法，統(tǒng)計(jì)添加不同組別對種蛋孵化率的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，顯著性差異采用SPSS15.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同封口方式對雞胚發(fā)育的影響

不同封口方式對種蛋孵化率的影響結(jié)果見表1。3種不同封口方式的孵化率均高于傳統(tǒng)封口方法的孵化率（32%），且均高于42.5%。3種不同封口方法的孵化率差異均不顯著（P＞0.05），但以膜+膠法的孵化率最高，為47.5%。但3種封口方式與對照組相比均差異極顯著(P＜0.01)，說明種蛋開窗后嚴(yán)重影響雞胚的發(fā)育，大幅度降低了種蛋的孵化率。

2.2 不同熟練程度的操作者進(jìn)行種蛋開窗后孵化率的影響

從表2看，熟練操作者A通過赤道面開窗的孵化率普遍高于不熟練操作者B，說明操作熟練程度可以影響種蛋孵化率，但熟練操作者的孵化率與未開窗的對照組相比，孵化率明顯較低，說明種蛋開窗對孵化率影響較大。

2.3 開窗添加液體排除空氣對雞胚孵化率的影響

從表3看，通過補(bǔ)充液體來排除空氣，以期提高孵化率的效果不明顯，且比不補(bǔ)液的組別孵化率稍低，但無顯著性差異（P>0.05）。而且在操作中，通過注射液體的方式，很難將空氣排盡，在封口時(shí)大部分種蛋中有小氣泡，但氣泡的大小以及氣泡的有無對孵化率的影響無顯著差異。

3 討論

種蛋開窗后導(dǎo)致孵化率下降的原因較多，主要有以下原因：

（1）開窗和貼膜后可導(dǎo)致種蛋內(nèi)氣體和水分蒸發(fā)。實(shí)驗(yàn)過程中對孵化期中死亡的種蛋進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，很多種蛋窗口內(nèi)表面形成濃蛋清粘連，主要因?yàn)榉N蛋開窗處理后，開窗處蛋清水分蒸發(fā)加快，從而形成粘連，影響了雞胚羊膜以及尿囊膜的發(fā)育，從而影響種蛋孵化率。

（2）開窗后進(jìn)入種蛋的空氣泡對胚胎發(fā)育有害[2]。開窗會導(dǎo)致雞胚發(fā)育畸形和致死，特別對胚胎早期影響較大。開窗時(shí)容易使種蛋內(nèi)容物暴露于空氣中，開窗產(chǎn)生的空氣泡明顯對雞胚有害，盡管在封口前采取排除氣泡的措施，但大部分死亡的胚胎中仍然存在氣泡，從而證實(shí)氣泡對種蛋孵化的損傷作用[3]。

[1]鄧緣. 雞X 期胚盤細(xì)胞的冷凍保存及復(fù)蘇后嵌合體雞制備的研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文,2009.

[2]燕海峰，文 平，鄧 緣,等. 種蛋開窗技術(shù)及其對雞胚發(fā)育影響的研究[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，2008,17（6）:834-839.

[3]賈存靈，張旭華，李旭博等. 種蛋開窗部位及封口方法對雞胚發(fā)育的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009,(10):38-39.